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Scientific Reports Band 6, Artikelnummer: 22199 (2016) Diesen Artikel zitieren

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Eine der größten Herausforderungen bei der Entwicklung von Biosensoren für die Krebsdiagnose besteht darin, eine kostengünstige und selektive Sonde einzuführen, die Krebszellen erkennen kann. In diesem Artikel haben wir die Phagen-Display-Technologie und die elektrochemische Impedanzspektroskopie (EIS) kombiniert, um einen markierungsfreien Zytosensor für den Nachweis von Krebszellen zu entwickeln, ohne komplizierte Reinigung der Erkennungselemente. Die Herstellungsschritte der Cytosensor-Schnittstelle wurden durch EIS überwacht. Aufgrund der hohen Spezifität der angezeigten Octapeptide und des Aviditätseffekts ihrer Mehrfachkopie-Darstellung auf dem Phagengerüst, der guten Biokompatibilität rekombinanter Phagen, der faserigen Nanostruktur von Phagen und den inhärenten Vorzügen der EIS-Technologie zeigte der vorgeschlagene Zytosensor einen breiten linearen Bereich (2,0). × 102 − 2,0 × 108 Zellen ml−1), eine niedrige Nachweisgrenze (79 Zellen ml−1, S/N = 3), hohe Spezifität, gute Inter- und Intra-Assay-Reproduzierbarkeit und zufriedenstellende Lagerstabilität. Diese neuartige Strategie zur Entwicklung von Zytosensoren wird eine neue Perspektive für eine schnelle und markierungsfreie elektrochemische Plattform für die Tumordiagnose eröffnen.

Angesichts der steigenden Krebsinzidenz und der anhaltend hohen Krebssterblichkeit auf der ganzen Welt haben die Frühdiagnose von Krebs und die Überwachung der Krebstherapie vor Ort große Aufmerksamkeit auf sich gezogen1,2. Bis heute haben verschiedene Analysemethoden, darunter Chemilumineszenz3, Quarzkristall-Mikrowaagen-Biosensor4, Oberflächenplasmonenresonanz5, radiologische Untersuchung6, Endoskop7, Computertomographie8 und elektrochemische Ansätze, wachsendes Interesse für die Erkennung von Krebszellen geweckt. Kürzlich wurden elektrochemische Methoden wie die elektrochemische Rastermikroskopie9, die Elektrochemilumineszenz10, die elektrochemische Impedanzspektroskopie (EIS)11 und die elektrische Zell-Substrat-Impedanzmessung12 entwickelt. Unter ihnen hat EIS aufgrund seiner bemerkenswerten Vorteile großes Interesse geweckt. Erstens ist EIS ein wirksames Werkzeug zur empfindlichen und schnellen Überwachung kleinster Änderungen der Elektrodenschnittstelle. Zweitens ist EIS im Gegensatz zu Störungstechniken mit großer Amplitude (wie zyklischer Voltammetrie und Differenzpulsvoltammetrie) aufgrund der Störung mit kleiner Amplitude eine zerstörungsfreie Technik13. Zu guter Letzt ist es nicht erforderlich, während der Impedanzmessung eine Markierung einzuführen14. Daher wurden durch die Erfassung von EIS-Daten der Elektrodenschnittstelle bei Gleichstrom15 die markierungsfreien elektrochemischen Impedanzzytosensoren aufgrund der inhärenten Vorteile wie markierungsfreies Verfahren, einfache Bedienung, hohe Empfindlichkeit und kurze Analyse zunehmend für die klinische Diagnose von Tumoren untersucht Zeit, Miniaturisierung und Potenzial der Automatisierung16.

Basierend auf der Affinitätsinteraktion benötigt ein markierungsfreier Impedanzzytosensor normalerweise eine Art Erkennungselement, um Ziele oder Analyten14 selektiv einzufangen, wie z. B. Antikörper17,18, Lektin19,20, Rezeptorprotein21, DNA-Aptamer22 und Kohlenhydrate13. Beispielsweise haben Maalouf et al. gelang der markierungsfreie Nachweis von E. coli durch EIS unter Verwendung biotinylierter polyklonaler Antikörper, die auf der Goldelektrode (AuE) immobilisiert waren18. Hu et al. entwickelte einen EIS-Zytosensor zur quantitativen Bestimmung menschlicher BXPC-3-Bauchspeicheldrüsenkrebszellen durch monoklonale antikarzinoembryonale Antigen-Antikörper als Erkennungselement23. Li et al. untersuchten eine mit einem monoklonalen Antikörper bedeckte Indium-Zinn-Oxid-Elektrode für die EIS-Erkennung von E. coli ohne enzymatische Signalverstärkung17. Cao et al. berichteten über einen Zytosensor, der auf Protein-anorganischen Hybrid-Nanoblumen basiert, die mit einem zielgerichteten Lektinmolekül (Sambucus nigra-Agglutinin) konjugiert sind, um menschliche DLD-1-Dickdarmkrebszellen zu erkennen24. Wan et al. stellten einen impedimetrischen Zytosensor für den markierungsfreien und schnellen Nachweis von Desulforibrio caledoiensis her, indem sie Lektin (Concanavalin A, Con A) auf der Oberfläche von AuE20 immobilisierten. Gamella et al. stellte markierungsfreies siebgedrucktes AuE für den EIS-Nachweis von Bakterien durch die selektive Wechselwirkung von Lektin (Con A) mit der Kohlenhydratkomponente von der E. coli-Zelloberfläche her25. Die Labib-Gruppe entwickelte zwei EIS-Biosensoren zum getrennten Nachweis von Salmonella enteritidis26 und Salmonella typhimurium22 durch hochspezifisches DNA-Aptamer, das auf Au-Nanopartikeln/Siebdruck-Kohlenstoffelektrode immobilisiert ist. Guo et al. entwickelten einen markierungsfreien EIS-Biosensor für E. coli ORN 178 durch Selbstorganisation eines thiolterminierten α-Mannosids und eines thiolterminierten Oligoethylenglykol-„Spacer“-Moleküls auf AuE13. Allerdings schränken einige inhärente Nachteile der herkömmlichen Erkennungselemente ihre analytischen Anwendungen ein. Einerseits sind Proteinerkennungselemente (Antikörper, Lektin und Rezeptorprotein) und DNA-Aptamer kompliziert in der Herstellung und Reinigung und weisen keine Stabilität unter verschiedenen Überwachungsbedingungen oder bei Langzeitlagerung auf27. Andererseits weisen Kohlenhydrate zwar die Vorzüge einer guten Stabilität auf, erfordern jedoch immer noch einen komplizierten Funktionalisierungsprozess und die Verwendung toxischer organischer Reagenzien28. Darüber hinaus mangelt es Kohlenhydraten im Vergleich zu anderen Erkennungselementen an Spezifität. Daher ist es äußerst wünschenswert, einfache, stabile und spezifische molekulare Sonden zu erforschen, um die diesen typischen Erkennungselementen innewohnenden Einschränkungen zu überwinden.

Phagendisplay ist eine Technologie, die die Expression von Polypeptiden oder Proteinen auf der Oberfläche von Phagen ermöglicht, indem die entsprechende Fremd-DNA in die Gene eingefügt wird, die für die Hüllproteine ​​kodieren29. Einer unserer Mitarbeiter konstruierte Petrenko die erste Phagenbibliothek vom Typ f8/8 mit dem Namen „Landscape-Phagen-Bibliothek“, die Milliarden zufälliger Octapeptide am N-Ende des Haupthüllproteins pVIII des fd-tet-Phagen30, Landschaftsphagen, präsentiert Bibliotheken sind zu einer wirksamen Quelle geworden, um durch Biopanning (ein biologisches evolutionäres Selektionsverfahren) spezifische peptidfusionierte Phagen zu erhalten, die verschiedene Analyten binden31. Durch die Darstellung spezifischer Liganden wurde die Phagen-Display-Technologie in verschiedenen Bereichen weit verbreitet eingesetzt, beispielsweise in der Biomineralisierung32,33, dem Epitop-Screening34, der Krebsdiagnose und -therapie35,36, der gezielten Arzneimittelabgabe37 und der Biosensorik31,38. Die ausgewählten Phagen weisen viele Vorteile auf, wie z. B. Multivalenz, hohe Spezifität, hervorragende Stabilität in extremen Umgebungen und einfache Herstellung im großen Maßstab ohne komplizierte Reinigungsverfahren39. Darüber hinaus können die filamentösen Phagen als „Träger“ spezifischer Polypeptide verwendet werden, wodurch die Herausforderung der Immobilisierung von Polypeptiden verringert wird40,41,42,43.

Zur Untersuchung des phagenbasierten Zytosensors wurden die kolorektalen Karzinomzellen SW620 als Modellziele verwendet, die aus metastatischen Läsionen von Dickdarmkrebs abgeleitet wurden44. In unserer vorherigen Arbeit haben wir den mit Octapeptid fusionierten Phagen (DDAGNRQP) erhalten, indem wir die f8/8-Landschaftsphagenbibliothek gegen menschliche kolorektale Karzinomzellen SW620 gescreent haben. Die biomimetische Nanostruktur wurde aus heterogenen Au@Ag-Nanostäben und spezifischen Fusions-pVIII-Proteinen selbstorganisiert, die zur Biobildgebung und photothermischen Therapie des gezielten Tumors geeignet waren45. In dieser Arbeit wurde ein markierungsfreier EIS-Zytosensor für Krebszellen entwickelt, indem die oben genannten spezifischen Octapeptid-fusionierten Phagen auf der Elektrodenoberfläche immobilisiert wurden. Der so hergestellte Zytosensor war empfindlich, selektiv, zuverlässig und stabil, was von den inhärenten Vorzügen phagenpräsentierter spezifischer Octapeptide und der Überlegenheit von EIS profitierte. Nach unserem besten Wissen ist dies das erste Beispiel eines Impedanzzytosensors, der auf spezifischen peptidfusionierten Phagen basiert. Diese Arbeit wird einen neuen Weg zur Herstellung phagenbasierter Sensoren zur Erkennung von Krebszellen eröffnen.

Die Gesamtzahl der zellspezifischen SW620-Phagen aus der f8/8-Phagenbibliothek wurde spektrophotometrisch bestimmt. Die gereinigte Phagenlösung wurde mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf die erforderliche Konzentration verdünnt. Das typische UV-Spektrum der gereinigten Phagenpräparation ist in Abbildung S1 (Hintergrundinformationen) dargestellt. Basierend auf der Formel41: Virionen (vir)/ml = (A269 × 6 × 1016)/Anzahl der Nukleotide im Phagengenom, wobei A269 die Absorption bei 269 nm ist. Für die in dieser Arbeit verwendeten rekombinanten Phagen (9198 Nukleotide) wurde eine Absorptionseinheit (A269) = 6,52 × 1012 vir/ml verwendet, um die Konzentration der Phagenpartikel in der Lösung (physikalischer Titer) zu bestimmen. Die Konzentration der so hergestellten Phagenpartikel wurde mit 9,13 × 1013 vir/ml berechnet.

Vor der Herstellung des Zytosensors wurde ein kontinuierliches zyklisches voltammetrisches (CV) Scannen der AuEs in H2SO4-Lösung durchgeführt, um die AuEs nahezu einschlussfrei und aktiviert zu machen. Anschließend wurden Bioerkennungselemente durch den schichtweisen Aufbau von 3-Mercaptopropionsäure (MPA), 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDC)/N-Hydroxysuccinimid auf der Biosensoroberfläche immobilisiert ( NHS) und Phagen (Abb. 1). Um den Herstellungsprozess des Biosensors und die Erkennung von Analyten auf der Elektrodenoberfläche zu überwachen, haben wir die EIS-Methode übernommen, die aufgrund ihrer empfindlichen Reaktion und schnellen markierungsfreien Erkennung häufig zur Überwachung der Änderungen des Elektrodenoberflächenzustands verwendet wird16,46. Darüber hinaus wurde EIS als zerstörungsfreie Technik auch für phagenbasierte Sensoren als geeignet erachtet13. Aufgrund seiner Ungiftigkeit für lebende Zellen wurde die [Fe(CN)6]3−/4−-Lösung als Redoxsonde23 verwendet. Zur Analyse der EIS-Daten wurden das Nyquist-Diagramm und das Randles-Ersatzschaltbildmodell angewendet15,16. Der Halbkreisdurchmesser des Nyquist-Diagramms entspricht dem Elektronentransferwiderstand (Ret), der sich aus der Isolationsfähigkeit der Elektrodenoberfläche ergibt. Daher zeigt Ret die Veränderung der Isolierschicht an, die die Übertragung der Redoxsonde auf die Elektrodenoberfläche behindert.

Schematische Darstellung des phagenbasierten Zytosensors für Krebszellen.

Wie in Abb. 2A gezeigt, änderten sich die Nyquist-Diagramme schrittweise mit der sukzessiven Modifikation der Au-Elektrodenoberfläche. Basierend auf dem Randles-Ersatzschaltbildmodell wurden die Impedanzdaten in entsprechende elektronische Elemente eingepasst und die sukzessive geänderten Ret-Werte intuitiv durch ein Histogramm dargestellt (Abb. 2B). Nach einer Reihe von Vorbehandlungen wurde die blanke Au-Elektrodenoberfläche gereinigt und aktiviert und zeigte eine gute Elektronentransferrate mit einem Ret-Wert von 79,9 ± 6,4 Ω. Dann wurde MPA kovalent an die Au-Elektrodenoberfläche gebunden, um durch die starke Wechselwirkung von Au-S-Bindungen eine Carboxylmonoschicht zu bilden, und der Ret-Wert stieg auf 578 ± 21 Ω, was auf die Bildung einer isolierenden MPA-Schicht hinweist. Danach wurden die Carboxylgruppen sofort durch EDC/NHS aktiviert und der Ret-Wert leicht auf 703 ± 29 Ω erhöht. Mit der Phagenassemblierung stieg der Ret-Wert deutlich auf 2245 ± 42 Ω, was auf den Erfolg der kovalenten Immobilisierung des Phagen auf der Oberfläche der Au-Elektrode durch Kondensationsreaktion zwischen Carboxylgruppe und Amingruppe hinweist. Der bemerkenswerte Anstieg von Ret könnte auf eine ausreichende Bindungszeit und die optimale Phagenkonzentration sowie auf die erwartete Hinderung der Redoxsonde [Fe(CN)6]3−/4− an der Elektrodenoberfläche zurückzuführen sein. Um unspezifische physikalische Adsorption und kovalente Bindung zwischen Aminogruppen auf der Zelloberfläche und restlichem aktiviertem Carboxyl von MPA zu vermeiden, wurde der Sensor mit 0,2 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBST blockiert. Das nichtionische Tensid 0,05 % Tween-20 in PBST kann dazu beitragen, unerwünschte unspezifische Adsorption teilweise zu vermeiden42. Der leichte Anstieg von Ret auf 2411 ± 49 Ω deutete darauf hin, dass der größte Teil des aktivierten Carboxyls von MPA kovalent an Phagen gebunden war. Für den Immunoassay wurden die Ziel-SW620-Zellen über eine hochspezifische Interaktion zwischen Fusions-Octapeptiden von Phagen und Proteinmarkern von Zellen eingefangen. Es wurde ein hoher Ret von 4970 ± 114 Ω beobachtet, was darauf hinweist, dass die großen Zellen auf der Au-Elektrodenoberfläche immobilisiert wurden, um eine größere physikalische Barriere zwischen der Redoxsonde und der Elektrodenoberfläche zu bilden.

(A) Typische Nyqusit-Diagramme von EIS für die Herstellung und Anwendung des Zytosensors in [Fe(CN)6]3−/4−-Lösung. EIS-Ergebnisse wurden aufgezeichnet (a) an einer blanken Au-Elektrode, die elektrochemisch in 0,5 M H2SO4 vorbehandelt wurde, (b) nach der Bildung der MPA-Schicht, (c) nach der Aktivierung mit EDC/NHS, (d) nach der Immobilisierung spezifischer peptidfusionierter Phagen ( e) nach Blockierung mit BSA und (f) nach immunologischer Erkennung mit SW620-Zellen. Angelegtes Potenzial: +0,2 V (gegenüber SCE). Frequenzbereich: 10−1 Hz–105 Hz. (B) Ret für die obigen Schritte (a–f), angepasst an das Randles-Ersatzschaltbildmodell (Einschub). Cdl, Doppelschichtkondensator; Ret, Elektronentransferwiderstand; Z w, Warburg-Widerstand; Rs, Lösungswiderstand. (C) Typische CV-Kurven für die oben genannten Schritte.

Inzwischen lieferten CV-Kurven auch konsistente Informationen über die Elektrodenoberfläche (Abb. 2C). Unter Verwendung von [Fe(CN)6]3−/4− als elektrochemische Redoxsonde waren ein Paar reversibler Redoxpeaks für blankes AuE zu beobachten (Abb. 2C, Kurve a), was eine gereinigte und aktivierte Elektrodenoberfläche demonstrierte. Aufgrund der Abdeckung von MPA und der Blockierung aktiver Stellen auf AuE verringerte sich der Reaktionsstrom offensichtlich (Abb. 2C, Kurve b)47. Bei der weiteren Inkubation der EDC/NHS-Mischung wurde die negativ geladene Carboxylgruppe von MPA an EDC gebunden und dann durch NHS ersetzt. Da die Einführung einer positiven oder neutralen Succinimidgruppe von NHS die Übertragung der negativen Redoxsonde [Fe(CN)6]3−/4− auf die Elektrodenoberfläche weiter einschränkte, verringerte sich der Spitzenstrom weiter (Abb. 2C, Kurve c)48 . Darüber hinaus verringerten sich die CV-Reaktionen mit der sukzessiven Anordnung von Phagen, BSA und Zellen allmählich, bis die Stromspitzen nicht mehr sichtbar waren (Abb. 2C, Kurven d–f), was auf die Bedeckung mit isolierenden Schichten hinweist.

Um die Topographie der Funktionsoberfläche der Elektrode nach den oben genannten Montageschritten weiter zu untersuchen, wurden Rasterkraftmikroskop-Messungen (AFM) durchgeführt. Mehrere filamentöse Phagen mit einer Länge von ca. 1,3 μm und Durchmesser von ca. Bei der Inkubation mit ungesättigten Phagen wurden auf der Goldoberfläche 7 nm beobachtet (Abb. 3A). Die dichte Phagenschicht war nach der Inkubation in gesättigten Phagen deutlich zu erkennen (Abb. 3B). Die Phagen oder Phagenbündel wurden kovalent an die Goldoberfläche gebunden, um ein sich kreuzendes Zufallsnetzwerk zu bilden. Darüber hinaus könnten einige Sphäroidpartikel auf der Schicht vermutlich von der Windung filamentöser Phagen stammen49.

Typische AFM-Bilder, aufgenommen in Luft.

(A) Die ungesättigte Phagenschicht auf der Goldoberfläche (3 μm × 3 μm) nach 10-minütiger Inkubation in Phagenlösung. (B) Die gesättigte funktionelle Phagenschicht auf der Goldoberfläche (2 μm × 2 μm) nach 6-stündiger Inkubation in Phagenlösung und weiterer Blockierung mit 0,2 % BSA.

Um die Herstellung von Zytosensoren zu optimieren, haben wir einige wichtige Parameter untersucht, darunter die Phagenkonzentration, die Inkubationszeit des Phagen und die Inkubationszeit von BSA, die mit den Zelleneinfangfähigkeiten und der Erkennungseffizienz des Zytosensors zusammenhängen. Zunächst wurden die modifizierten Elektroden über Nacht in verschiedenen Phagenkonzentrationen (2,5 × 108 − 2,5 × 1013 vir/ml) inkubiert und die EIS-Spektren aufgezeichnet. Die EIS-Reaktionen zeigten eine Aufwärtstendenz von 2,5 × 108 auf 2,5 × 1011 vir/ml, während bei höheren Konzentrationen keine offensichtliche Veränderung beobachtet wurde (Abb. 4A). Daher wurde für die Elektrodenmodifikation eine Phagenkonzentration von 2,5 × 1011 vir/ml verwendet. Anschließend wurde die Inkubationszeit des Phagen (2,5 × 1011 vir/ml) optimiert. Die EIS-Reaktionen nahmen mit der Inkubationszeit zu und erreichten nach 6 Stunden ein Plateau (Abb. 4B), was darauf hinweist, dass die Menge der auf der Elektrode immobilisierten Phagen nach 6 Stunden gesättigt war. Da zahlreiche an der Elektrode modifizierte Phagen letztendlich für die Zellerkennung von Vorteil wären, wurde 6 Stunden als optimale Inkubationszeit für die Phagenimmobilisierung gewählt. Was die Blockierung mit BSA betrifft, zeigte der Ret eine steigende Tendenz mit zunehmender Inkubationszeit bis 30 Minuten (Abb. 4C). Somit war die Blockierung des Sensors nach 30 Minuten erreicht, was als optimale Blockierungszeit gewählt wurde.

Auswirkungen von (A) Phagenkonzentration, (B) Inkubationszeit von Phagen, (C) Inkubationszeit von BSA und (D) Inkubationszeit von SW620-Zellen auf die EIS-Reaktionen unter verschiedenen optimalen Bedingungen für die Herstellung von Zytosensoren.

Da die Inkubationszeit von Analyten das elektrochemische Signal direkt beeinflussen kann, haben wir die Auswirkung einer längeren Inkubationszeit von Zellen auf die EIS-Reaktionen untersucht. Wie in Abb. 4D gezeigt, zeigte Ret einen kontinuierlichen Anstieg während der einstündigen Inkubation, was darauf hindeutet, dass mit der Zeitakkumulation immer mehr Zellen vom Zytosensor erfasst wurden. Allerdings gab es nach 1 Stunde keine erkennbare Änderung des Ret-Werts, was darauf hindeutet, dass die Menge der auf der Oberfläche des Zytosensors eingefangenen Zellen gesättigt war. Daher betrug die optimale Inkubationszeit für die Reaktion zwischen spezifischem Phagen und Antikörper 1 Stunde.

Um die Leistung von Zytosensoren für den quantitativen Nachweis von Tumorzellen zu untersuchen, verwendeten wir das EIS-Analysesystem. Die EIS-Reaktion spiegelte direkt die Elektronentransfereffizienz zwischen der elektroaktiven Redoxsonde [Fe(CN)6]3−/4− und der Elektrodenoberfläche sowie die Abschirmwirkung der Zellschicht auf die Redoxsonde wider. Mit anderen Worten: Die Ret-Werte der Zytosensoren hingen von der Menge kovalent immobilisierter Zellen und der Erkennungsleistung der Phagen ab. Wie in Abb. 5A gezeigt, änderten sich die EIS-Reaktionen allmählich mit zunehmender Zellkonzentration von 200 auf 2,0 × 108 Zellen ml−1, was darauf hindeutet, dass die Menge der Redoxsonden, die zur Elektrode vordrang, allmählich verringert wurde. Nach der Anpassung der EIS-Daten an Ret-Werte durch das Ersatzschaltbildmodell konnte deutlich beobachtet werden, dass die Ret-Werte bei niedriger Zellkonzentration stark anstiegen, während sie bei hoher Zellkonzentration leicht anstiegen. Das Inkrement von Ret könnte als ΔRet = Ri − R0 definiert werden, wobei Ri der Ret-Wert nach der Inkubation der Zelle und R0 der Ret-Wert nach der Blockierung mit BSA, aber vor der Zellerkennung ist. Durch die weitere Datenverarbeitung stellten wir fest, dass die ΔRet-Werte proportional zum Logarithmus der Zellkonzentration waren (Abb. 5B). Die lineare Regressionsgleichung lautete ΔRet (Ω) = 420,21 lg C (Zellen mL−1) − 383,99 mit einem Korrelationskoeffizienten (R) von 0,995. Der große lineare Bereich von 2,0 × 102 −2,0 × 108 Zellen ml−1 (entspricht 2,0 − 2,0 × 106 in 10 μL Assayvolumen) und die niedrige Nachweisgrenze (LOD) von 79 Zellen ml−1 (S/N = 3) wurden erhalten. Der LOD war niedriger als die Werte der meisten bisher gemeldeten Zytosensoren, z. B. 794 HeLa-Zellen ml−1 beim Aptamer-basierten Impedanzsensor50, 100 HeLa-Zellen ml−1 beim Folsäure-basierten elektrochemischen Zytosensor51, 90 HL-60-Zellen ml− 1 bei einem Impedanzsensor auf Basis niedermolekularer Liganden52, 620 BGC-823-Zellen ml−1 bei einem enzymgebundenen Tetrapeptid-basierten Sensor53 und 1,8 × 104 Jurkat-Zellen ml−1 bei einem Polylysin/GCE-Impedanzsensor54 (Tabelle S1). Diese Ergebnisse zeigten, dass die kovalente Immobilisierung spezifischer Phagen zu einem hocheffizienten Einfangen von Tumorzellen auf der Elektrodenoberfläche führte. Daher war der hergestellte Sensor empfindlich für die Erkennung von Zielzellen.

(A) EIS-Antworten hergestellter Zytosensoren nach immunologischer Erkennung mit unterschiedlichen Konzentrationen von SW620-Zellen: (a) 0, (b) 2,0 × 102, (c) 2,0 × 103, (d) 2,0 × 104, (e) 2,0 × 105 , (f) 2,0 × 106, (g) 2,0 × 107 und (h) 2,0 × 108 Zellen ml−1. (B) Die Kalibrierungskurve für SW620-Zellen: das ΔRet als Funktion der Logarithmuswerte der SW620-Zellenkonzentration.

Um die Spezifität des vorgeschlagenen Zytosensors für den Nachweis von SW620-Zellen zu untersuchen, wurden Kontrollzellen, einschließlich HEK293T und HepG2, als potenzielle Störfaktoren angesehen. Kontrollzellen und Zielzellen SW620 wurden jeweils mit dem so vorbereiteten Zytosensor unter den gleichen Bedingungen inkubiert. Bei den so hergestellten Zytosensoren wurden im Vergleich zum scharfen ΔRet-Wert für SW620 (blaue Spalte in Abb. 6) keine offensichtlichen ΔRet-Werte für Interferenzen beobachtet, was eine hohe Spezifität des hergestellten Zytosensors und eine eliminierbare physikalische Adhäsion von Zellen an der Elektrode zeigt. Angesichts der Komplexität des echten Blutes wurde der ΔRet-Wert für die Mischung aus Krebszellen (SW620 und HepG2) und gesunden Zellen (HEK293T) im menschlichen Serum ermittelt, der im Vergleich zum Fall von SW620 einen relativen Fehler von +4,1 % aufwies nur. Daher wies der vorgeschlagene Zytosensor eine ausgezeichnete Zuverlässigkeit für echte Proben auf. In der Zwischenzeit wurden auch die nicht blockierenden Sensoren in derselben Versuchsreihe eingesetzt, um den Effekt der Blockierung mit BSA zu überprüfen (rote Spalte in Abb. 6). Es konnte beobachtet werden, dass im Vergleich zum BSA-blockierten Zytosensor alle nicht blockierenden Sensoren einen offensichtlichen Anstieg des ΔRet-Werts zeigten, was darauf hindeutet, dass der Blockierungseffekt eine unspezifische Adsorption auf der Elektrodenoberfläche verhinderte. Diese Ergebnisse bestätigten nicht nur die hohe Selektivität des phagenbasierten Zytosensors, sondern auch die Notwendigkeit einer Blockierung des Sensors.

Das typische ΔRet der vorgeschlagenen Zytosensoren (blau) und nicht-BSA-blockierenden Zytosensoren (rot) nach jeweiliger Inkubation mit menschlichen kolorektalen SW620-Karzinomzellen, HepG2-Hepatomkarzinomzellen, menschlichen embryonalen Nierenzellen HEK293T und der Mischung der oben genannten Zellen im Serum . Alle Zellen hatten die gleiche Konzentration von 2,0 × 108 Zellen ml−1.

Als wesentliche Parameter des Biosensors muss die Inter- und Intra-Assay-Reproduzierbarkeit untersucht werden. Einerseits wurden SW620-Zellen (2,0 × 105 Zellen ml−1) in fünf unabhängigen Experimenten unter Verwendung verschiedener frisch hergestellter Zytosensoren nachgewiesen. Die relative Standardabweichung (RSD) betrug 4,9 %, was auf eine akzeptable Reproduzierbarkeit der hergestellten Zytosensoren hinweist. Andererseits wurden bei fünf Wiederholungsnachweisen zwei unterschiedliche Konzentrationen von SW620-Zellen nachgewiesen. Der RSD betrug 3,1 % bzw. 2,6 % für 2,0 × 105 bzw. 2,0 × 107 Zellen ml−1, was auf eine gute Präzision des Zytosensors für den Zellnachweis hinweist.

Darüber hinaus blieb der hergestellte Zytosensor nach 30-tägiger Lagerung bei 4 °C bei 92,4 % seiner ursprünglichen Signalantwort, was auf eine zufriedenstellende Lagerstabilität schließen lässt, die dem auf Antikörper oder Aptamer basierenden Zytosensor überlegen ist. Diese hervorragende Stabilität könnte auf die Tatsache zurückgeführt werden, dass der Landschaftsphagen unbegrenzt bei 4–8 °C gelagert werden kann39.

Eine der größten Herausforderungen beim Design von Biosensoren für die Krebsdiagnose besteht darin, eine kostengünstige und selektive Sonde zu entwickeln, die überexprimierte Krebszellrezeptoren erkennen kann. Hier haben wir die Phagen-Display-Technologie und die EIS-Technologie kombiniert, um erstmals einen markierungsfreien Zytosensor zur Erkennung von Krebszellen zu entwickeln, ohne aufwändige Reinigung von Erkennungselementen. Experimentelle Ergebnisse zeigten, dass der phagenbasierte EIS-Zytosensor für SW620-Kolorektalkarzinomzellen markierungsfrei, ultraempfindlich, selektiv, zuverlässig und stabil war und von den inhärenten Vorzügen sowohl der phagenpräsentierten spezifischen Octapeptide als auch der EIS-Technologie profitierte.

Einerseits ist es bemerkenswert, dass die Multivalenz und Struktur von Landschaftsphagen als Displaygerüst spezifischer Sonden einen wesentlichen Beitrag leisteten. Erstens könnten homologe Octapeptide aufgrund des Aviditätseffekts der Mehrfachkopie-Anzeige auf der Oberfläche des Phagen erhöhte Affinitäten und eine hohe Spezifität aufweisen55. Zweitens ist die filamentöse Struktur des fd-Phagen flexibel, um eine geeignete Konformation für die Interaktion mit der großen Krebszelle bereitzustellen. Mittlerweile verfügt eine Zelle im Allgemeinen über viele Biomarker für den Erkennungsliganden52. Dies bedeutet, dass sich mehr Erkennungsstellen in der Zelle mit spezifischeren Oktapeptiden am flexiblen filamentösen Phagen verbinden könnten und der Erkennungsprozess effizienter und die Bindung fester wäre. Drittens waren die spezifischen Octapeptide auf dem Phagengerüst in komplexen Umgebungen äußerst stabil, sodass der entsprechende Sensor stabil und wiederholbar war39. Viertens sind Landschaftsphagen für tierische Zellen harmlos und könnten die Biokompatibilität des Sensors verbessern. Andererseits beruhte die Überlegenheit des hergestellten Sensors auch auf den inhärenten Vorzügen der EIS-Technologie. Da die EIS-Technik erstens die winzigen Impedanzänderungen der Elektrodenschnittstelle überwachen kann, war der hergestellte Impedanzzytosensor ultraempfindlich und markierungsfrei. Zweitens ist EIS aufgrund der geringen Amplitudenstörung eine zerstörungsfreie Technik, die zu einem stabilen und zuverlässigen Biosensor führt. Diese Überlegenheiten wurden für andere Erkennungselemente nicht erreicht. Im Hinblick auf den phagenbasierten Biosensor haben Penner et al. entwickelte den M13-Phagen-basierten Impedanzbiosensor zum Nachweis von Antigen49. Allerdings ist die Spezifität des M13-Phagen unklar. Darüber hinaus wurden die auf Phagensonden basierenden Impedanzbiosensoren noch nicht zum Nachweis von Zellen eingesetzt. Es ist äußerst wünschenswert, neuartige Biosensoren für Krebszellen zu entwickeln. Darüber hinaus war unsere Strategie zum Screening spezifischer Sonden basierend auf unserer f8/8-Landschafts-Phagen-Display-Bibliothek effektiver, da sich auf einer Phagenoberfläche 4000 Kopien spezifischer Octapeptide befinden. Das heißt, es gibt 4000 Erkennungsstellen für die Ziele, die mit anderen Phagen-Display-Methoden nicht erreicht werden könnten. Daher ist es möglich, den empfindlichen und selektiven Nachweis von Zielzellen zu realisieren.

Darüber hinaus war das Herstellungsverfahren des Zytosensors einfach. Erstens war die Herstellung spezifischer peptidfusionierter Phagen in großem Maßstab einfach und ohne komplizierte Reinigungsverfahren39. Zweitens stellte das Phagendisplay einen filamentösen Phagen-„Träger“ für die spezifische Sonde bereit und reduzierte die komplizierten Schritte der Polypeptidimmobilisierung (die im Allgemeinen die Synthese und Reinigung des freien Peptids, die Anbringung eines Linkers an den Biosensor und schließlich die Konjugation des Peptids erforderten). der Einzelphagen-Biokonjugationsschritt42,53. Drittens macht die EIS-Technologie die praktische Anwendung des markierungsfreien Sensors ohne den komplizierten Prozess möglich, einschließlich der Bindung der Markierung an spezifische Moleküle und der Erkennung spezifischer Moleküle an der Zielzelle.

Abschließend haben wir eine Strategie für einen spezifischen peptidfusionierten Phagen-Zytosensor für den ultraempfindlichen Nachweis von Krebszellen vorgestellt. Der vorgeschlagene Zytosensor zeigte einen breiten linearen Nachweisbereich, eine niedrige Nachweisgrenze, eine hohe Spezifität, gute Reproduzierbarkeit und eine zufriedenstellende Lagerstabilität. Die hervorragende analytische Leistung des phagenbasierten Sensors könnte auf die gute Biokompatibilität rekombinanter Phagen, die hohe Spezifität der auf der Oberfläche präsentierten Octapeptide, die Nanostruktur der faserigen Phagen selbst und die inhärenten Vorteile der EIS-Technologie zurückgeführt werden. Der phagenbasierte, markierungsfreie Impedanzzytosensor mit zugänglichen Phagenerkennungselementen, einfacher Bedienung und hervorragender analytischer Leistung würde eine alternative Technik zur Erkennung von Krebszellen bieten.

MPA, 2-(N-morpholino)-ethansulfonsäure (MES), EDC und NHS wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) bezogen. BSA, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) und fötales Rinderserum (FBS) wurden von Solarbio (Peking, China) bezogen. Tween 20 und Polyethylenglykol (PEG) stammten von Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, China). Alle anderen Reagenzien waren von analytischer Qualität und wurden ohne weitere Reinigung wie erhalten verwendet. Alle Lösungen wurden mit Milli-Q-Wasser (18,0 MΩ cm) hergestellt. [Fe(CN)6]3−/4−-Lösung wurde mit 10 mM K3Fe(CN)6, 10 mM K4Fe(CN)6 und 0,1 M KCl (als Grundelektrolyt) in Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) hergestellt Wird als Redoxsonde im elektrochemischen Detektionssystem verwendet.

Kulturen der Zielzellen (SW620) und Kontrollzellen (HEK293T und HepG2) wurden bereits beschrieben45. Kurz gesagt, die Zellen wurden in der Flasche kultiviert, die DMEM, ergänzt mit 100 μg/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 10 % FBS, enthielt. Nach einer Kulturperiode in einem befeuchteten Zellinkubator mit 5 % CO2 bei 37 °C wurden die Zellen mit 0,25 % Trypsin in PBS trypsinisiert, durch 5-minütige Zentrifugation bei 1000 U/min gesammelt und dann zweimal mit PBS-Puffer gewaschen. Die Zellpellets wurden als Stammlösung suspendiert und für elektrochemische Messungen mit PBS-Puffer auf unterschiedliche Konzentrationen verdünnt. Die Endkonzentration der Stammlösung wurde mit einem Petroff-Hausser-Zellzähler gemessen.

Die Details zur Auswahl spezifischer Phagen-präsentierter Octapeptide durch Biopanning finden Sie in unserer früheren Arbeit45. Die Herstellung des Phagen mit den Fusions-Octapeptiden wurde bereits von unseren Mitarbeitern35,36,56 beschrieben. Die ausgewählten Phagen wurden einfach durch Beugen von E. coli K91 BlueKan-Wirtszellen amplifiziert und kloniert. Abschließend wurden die Phagen durch PEG/NaCl-Fällung gereinigt und anschließend titriert57.

Vor der Modifizierung der AuEs (3 mm Durchmesser) wurden die AuEs mit 0,02 μm Aluminiumoxidaufschlämmung auf einem Mikrotuchpad poliert und mit Wasser im Ultraschall gewaschen. Die AuEs wurden durch CV in 0,5 M H2SO4-Lösung für 40 Zyklen im Potentialbereich von 0 − + 1,5 V bei einer Scanrate von 0,1 V/s gereinigt und aktiviert. Nach dem Waschen der AuEs wurden die Zytosensoren durch einen schichtweisen Selbstorganisationsprozess hergestellt. Zuerst wurden die AuEs 12 Stunden lang in einer wässrigen 0,25 M MPA-Lösung inkubiert, um eine gesättigte MPA-Monoschicht zu bilden, gefolgt von einem Waschen mit Wasser57. Die Carboxylgruppe von MPA wurde dann durch Inkubation der modifizierten Elektrode in 0,1 M MES-Puffer (pH 5,0), der 50 mM EDC und 30 mM NHS enthielt, für 5 Stunden aktiviert, um die terminale Carboxylgruppe von MPA in aktiven NHS-Ester umzuwandeln57. Als nächstes wurden die modifizierten Elektroden mit PBS gespült und 6 Stunden lang in Phagenlösung (2,5 × 1011 vir/ml) bei 4 °C inkubiert, um die Aminogruppe der Phagenoberfläche mit der Carboxylgruppe von MPA zu binden. Nach gründlichem Waschen mit PBST zur Entfernung ungebundener Phagen wurden die modifizierten Elektroden 30 Minuten lang mit 0,2 % BSA in PBST blockiert, um die unspezifische Bindung von Analyten oder Verunreinigungen zu reduzieren. Zum Nachweis von Zellen wurden 10 μl Zellsuspensionen auf die Oberflächen der modifizierten Elektroden getropft und 1 Stunde lang bei 37 °C unter feuchten Bedingungen inkubiert. Vor der elektrochemischen Messung wurden die phagenbasierten elektrochemischen Zytosensoren vorsichtig und gründlich mit PBS gewaschen, um alle unspezifisch adsorbierten Zellen zu entfernen.

Das UV-Absorptionsspektrum der präsentierten Phagenlösung wurde mit einem UV-1800-Spektrophotometer (Shimadzu, Kyoto, Japan) durchgeführt. Elektrochemische Messungen einschließlich EIS und CV wurden auf einer elektrochemischen Workstation CHI 660D (CH Instruments, Chenhua, Shanghai, China) mit einem herkömmlichen Drei-Elektroden-System durchgeführt, das aus einer modifizierten Elektrode als Arbeitselektrode, einem Platindraht als Hilfselektrode und gesättigter Elektrode bestand Kalomelelektrode (SCE) als Referenzelektrode. Alle elektrochemischen Messungen wurden in [Fe(CN)6]3−/4−-Lösung durchgeführt. Die EIS-Spektren wurden bei 0,2 V im Frequenzbereich von 10−1−105 Hz und einer Amplitude von 5,0 mV aufgenommen. Die AFM-Messung wurde in Luft bei Umgebungsdruck und Luftfeuchtigkeit auf dem Agilent 5400 AFM-System mit Tapping-Modus und einer Scanrate von 0,5 Zeilen/s durchgeführt. Die Datenanalyse wurde mit der Picoview-Software 1.8 von Agilent Technologies durchgeführt.

Zitierweise für diesen Artikel: Han, L. et al. Ein markierungsfreier Zytosensor mit elektrochemischer Impedanz, der auf einem spezifischen peptidfusionierten Phagen basiert, der aus der Landscape-Phagenbibliothek ausgewählt wurde. Wissenschaft. Rep. 6, 22199; doi: 10.1038/srep22199 (2016).

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Diese Arbeit wurde finanziell von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 91227116, 21275152 und 21475144 an AHL) und dem National Institute of Health US-Zuschuss 1U54CA151881-0 (an VAP) unterstützt.

Institut für Biosensorik und In-vitro-Diagnostik und Hochschule für Medizin, Universität Qingdao, 38 Dengzhou Road, Qingdao, 266021, China

Lei Han & Aihua Liu

Labor für Biosensorik, Qingdao Institute of Bioenergy & Bioprocess Technology, Chinesische Akademie der Wissenschaften, 189 Songling Road, Qingdao, 266101, China

Lei Han, Pei Liu und Aihua Liu

Abteilung für Pathobiologie, College of Veterinary Medicine, Auburn University, 269 Greene Hall, Auburn, 36849-5519, Alabama, Vereinigte Staaten von Amerika

Valery A. Petrenko

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AHL und LH haben diese Forschung entworfen; LH und PL führten die Experimente durch. VAP half bei der Phagenpräsentation. Alle Koautoren analysierten die Ergebnisse, erstellten und überarbeiteten das Manuskript.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Dieses Werk ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe nichts anderes angegeben ist; Wenn das Material nicht unter der Creative-Commons-Lizenz enthalten ist, müssen Benutzer die Erlaubnis des Lizenzinhabers einholen, um das Material zu reproduzieren. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Nachdrucke und Genehmigungen

Han, L., Liu, P., Petrenko, V. et al. Ein markierungsfreier Zytosensor mit elektrochemischer Impedanz, der auf einem spezifischen peptidfusionierten Phagen basiert, der aus der Landscape-Phagenbibliothek ausgewählt wurde. Sci Rep 6, 22199 (2016). https://doi.org/10.1038/srep22199

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Eingegangen: 29. Oktober 2015

Angenommen: 09. Februar 2016

Veröffentlicht: 24. Februar 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/srep22199

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