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Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 9347 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Eleusine indica, das in der traditionellen Medizin verwendet wird, zeigt eine antiproliferative Wirkung gegen mehrere Krebszelllinien. Es fehlen jedoch noch metabolomische Studien zur Bewertung der durch E. indica in Krebszellen induzierten Metabolitenveränderungen. Die vorliegende Studie untersuchte die krebshemmenden Wirkungen einer Wurzelfraktion von E. indica (R-S5-C1-H1) auf die Zelllinien H1299, MCF-7 und SK-HEP-1 und analysierte metabolische Veränderungen in den behandelten Krebszellen mittels Ultra -Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und hochauflösende Massenspektrometrie (UHPLC-HRMS). Zellmetabolische Aktivitätstests zeigten, dass die Zelllebensfähigkeit der drei Krebszelllinien nach der Behandlung mit R-S5-C1-H1 deutlich reduziert war, wobei die halbmaximalen Hemmkonzentrationswerte 12,95 µg/ml, 15,99 µg/ml und 13,69 µg betrugen /ml nach 72 Stunden. Die mikroskopische Analyse unter Verwendung der Fluoreszenzfarbstoffe Hoechst 33342 und Annexin V ergab, dass mit R-S5-C1-H1 behandelte Zellen einen apoptotischen Zelltod erlitten, während die chemometrische Analyse darauf hinwies, dass die Apoptose 48 Stunden nach der Behandlung mit R-S5-C1-H1 ausgelöst wurde. Die entfaltete zelluläre Metabolomik ergab, dass hydrophobe Metaboliten signifikant verändert waren, darunter Triacylglycerine, Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Sphingomyelin und Ceramid, was darauf hindeutet, dass die Apoptose-Induktion durch R-S5-C1-H1 möglicherweise durch Modulation der Phospholipidsynthese und des Sphingolipid-Metabolismus erfolgte. Diese metabolomischen Profilierungsergebnisse liefern neue Einblicke in die Antikrebsmechanismen von E. indica und erleichtern das Gesamtverständnis molekularer Ereignisse nach therapeutischen Interventionen.

In the continuing battle of humans against cancer, which dates as far back as 3000 BC, the earliest written account of cancer is the description of breast cancer found in the Edwin Smith Papyrus1. Currently, cancer remains one of the leading causes of premature death among people aged between 30 and 69 years worldwide2,3. It is estimated that there were 19.3 million new cases in 20202 and almost 10.0 million deaths from cancer. Furthermore, the incidence of all cancers in Malaysia has been projected to almost double by 2040, from 48,639 to 86,666 new cases (2020)." href="/articles/s41598-022-13575-6#ref-CR4" id="ref-link-section-d279179327e580">4. Trotz jüngster therapeutischer Fortschritte5 beeinträchtigt diese Krankheit aufgrund der Einschränkungen der aktuellen Krebsbehandlungen weiterhin die Lebensqualität der Patienten.

Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation verlassen sich immer noch viele Menschen auf Kräutermedizin als primäre Gesundheitsquelle6. Daher spielen Pflanzen eine wichtige Rolle in der Gesundheitsrevolution. In der traditionellen chinesischen Medizin werden Kräuter zur Vorbeugung und Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten eingesetzt7. Beispielsweise förderten die Behörden in China den kombinierten Einsatz traditioneller chinesischer Medizin und westlicher Medizin zum Schutz und zur Behandlung von Patienten, die mit dem hochansteckenden neuartigen Coronavirus (SARS-CoV2) infiziert sind, ein Ansatz, der sich bisher als wirksam erwiesen hat8. In Pflanzen unterscheiden sich Sekundärmetaboliten von den Komponenten des Primärstoffwechsels, da sie nicht am regulatorischen Stoffwechsel beteiligt sind; Vielmehr dienen sie dazu, die Pflanze vor Raubtieren und dem Eindringen von Mikroorganismen zu schützen9. Jahrzehntelange phytochemische Forschung an über 150.000 Pflanzenarten hat gezeigt, dass sekundäre Metaboliten, darunter Phenole, Flavonoide, Terpenoide, Alkaloide und schwefelhaltige Verbindungen, eine Vielzahl interessanter biologischer Wirkungen haben10. Seit 1981 sind fast drei Viertel (64,9 %) der verschriebenen Krebsmedikamente pflanzlichen Ursprungs11. Daher gelten Heilpflanzen als wichtige und zuverlässige Quellen für die Entdeckung von Krebsmedikamenten12,13,14.

Unter Metabolomik versteht man die umfassende Untersuchung eines vollständigen Satzes kleiner Metaboliten (<1500 Da) in einer biologischen Probe15. Diese Technik erweitert die systembiologische Sicht auf Organismen, indem sie die Lücke zwischen Genotyp und Phänotyp schließt16,17. Metabolomics wird häufig in Studien zu Pflanzen, Tieren, Medikamenten und Lebensmitteln eingesetzt. Unter den in der Metabolomik eingesetzten Technologien, einschließlich Kernspinresonanz (NMR), Gaschromatographie (GC) und Flüssigkeitschromatographie (LC) in Verbindung mit Massenspektrometrie (MS), ist LC-MS die Technik der Wahl zum Nachweis und zur Bestimmung der Elementzusammensetzung und Molekülformel eines interessierenden Analyten, da sie ohne einen Derivatisierungsschritt durchgeführt werden kann. Darüber hinaus verringern die sanfte Ionisierung und die nicht übermäßige Wärmeanwendung in der LC zur chromatographischen Trennung die Wahrscheinlichkeit eines Verbindungsabbaus während der Profilierung18. Endogene und exogene Stoffwechselcharakterisierungen therapeutischer Wirkstoffe mithilfe der Hochdurchsatz-Metabolomik ermöglichen es Forschern, die Wirksamkeit und Sicherheit dieser Wirkstoffe zu bewerten19. In der Krebsforschung haben metabolomische Studien umfassende Informationen geliefert und das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen der Krebspathogenese und der Arzneimittelwirkungen durch die Bewertung metabolischer Veränderungen in Krebszellen verbessert20,21. Somit ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung der extrahierten Metaboliten die Überwachung der Reaktionen auf externe Reize in Testproben22,23.

Eleusine indica, auch Drahtgras oder Gänsegras genannt, ist eine der sechs diploiden Arten der Gattung Eleusine, die zur Familie der Poaceae24,25 gehört. Es kommt häufig in tropischen und subtropischen Regionen vor26,27 und besitzt bekanntermaßen reinigende, fiebersenkende, harntreibende und abführende Eigenschaften25,28,29. Traditionell wird die Pflanze häufig zur Behandlung von Bluthochdruck, Grippe, Oligurie und Urinretention eingesetzt25,30,31, während Abkochungen der gesamten Pflanze häufig als Antihelminthika und Fiebermittel eingesetzt werden32. Die Samen werden manchmal als Nahrungsmittel für Hungersnöte sowie zur Behandlung von Leberbeschwerden verwendet26. Es wurde berichtet, dass Extrakte von E. indica antiproliferative Wirkungen gegen verschiedene Arten menschlicher Krebszellen ausüben, darunter Rhabdomyosarkomzellen33, Lungenkrebszellen (A549) und Gebärmutterhalskrebszellen (HeLa)34. Obwohl frühere Forschungen das krebsbekämpfende Potenzial von E. indica aufgezeigt haben, fehlen weiterhin wissenschaftliche Beweise für die Wirksamkeit der Pflanzenextrakte gegen andere menschliche Krebszelllinien sowie metabolische Studien zur Bewertung der durch E. indica induzierten Metabolitenveränderungen in Krebszellen. Indica.

Daher zielte diese Studie darauf ab, i) die Auswirkungen von E. indica-Wurzelfraktionen auf die Lebensfähigkeit der Zellen und die Zellmorphologie beim menschlichen nichtkleinzelligen Lungenkarzinom (H1299), Brustadenokarzinom (MCF-7) und Leberadenokarzinom (SK-HEP) zu bewerten -1) Zellen; und ii) den Einfluss der aktivsten Fraktion auf die Stoffwechselprofile dieser Zellen mithilfe eines LC-MS-basierten Ansatzes untersuchen.

Das experimentelle Flussdiagramm ist in Abb. 1 dargestellt. Kurz gesagt, E. Indica wurde geerntet und für die Extraktion von Verbindungen vorbereitet, die gegen verschiedene Krebszelllinien getestet werden sollen. Die halbmaximalen Hemmkonzentrationen (IC50) der Fraktionen wurden für jede Zelllinie mithilfe von Zelllebensfähigkeitstests bestimmt, die 24, 48 und 72 Stunden nach der Behandlung durchgeführt wurden. Anschließend wurde eine Färbung mit Hoechst 33342 und Annexin V-Färbung durchgeführt, um den Mechanismus des Zelltods zu bestimmen. Gleichzeitig wurden Zellmetabolomics durchgeführt, um die Mechanismen aufzuklären, die den Zelltod auslösen. Kurz gesagt, schockgefrorene Zellen wurden einem Extraktionsprotokoll von Bligh und Dyer mit Modifikationen unterzogen, um polare und unpolare Metabolome zu trennen. Anschließend erfolgte die chromatographische Trennung der extrahierten Metabolome mittels Pentafluorphenylsäulen. Die Metabolomprofilierung wurde bei einem m/z-Bereich von 50–1500 unter Verwendung erhitzter Elektrospray-Ionisation sowohl im positiven als auch im negativen Modus durchgeführt. Die erfassten Daten wurden mit MZmine 235 vorverarbeitet, gefolgt von einer chemometrischen Analyse. Jedes statistisch signifikante Metabolom wurde einem weiteren Verbindungsabgleich und einer weiteren Analyse unterzogen.

Gesamter experimenteller Arbeitsablauf.

Bioassay-gesteuertes Screening von E. indica-Extraktfraktionen gegen H1299-, MCF-7- und SK-HEP-1-Zellen mithilfe kolorimetrischer 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assays zeigten, dass die Wurzelfraktion R-S5-C1-H1 die höchste Aktivität gegen alle Zelllinien aufwies (Abbildung S1); Diese Fraktion wurde daher für die weitere Analyse ausgewählt. Wie in Abb. 2 gezeigt, führte die Behandlung mit steigenden Konzentrationen von R-S5-C1-H1 in allen drei Krebszelllinien nach 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden zu einer deutlich verringerten Lebensfähigkeit der Zellen, wobei die deutlichsten Auswirkungen bei a beobachtet wurden Konzentration von 25 µg/ml. Bei den H1299- und MCF-7-Zelllinien nahm die Anzahl lebensfähiger Zellen mit der Behandlungsdauer allmählich ab, während bei SK-HEP-1-Zellen nach 72 Stunden ein starker Rückgang der Lebensfähigkeit zu verzeichnen war. Tabelle 1 zeigt die IC50-Werte für H1299-, MCF-7- und SK-HEP-1-Zellen nach 24-stündiger, 48-stündiger und 72-stündiger Behandlung mit der Fraktion R-S5-C1-H1; Als Positivkontrolle wurde Doxorubicin (Dox) verwendet. Die höchste R-S5-C1-H1-Aktivität nach 24 Stunden wurde in H1299-Zellen beobachtet (IC50 = 20,73 µg/ml), gefolgt von MCF-7 (IC50 = 29,89 µg/ml) und SK-HEP-1 (IC50). = 44,36 µg/ml) Zellen. Eine Verlängerung der Behandlung auf bis zu 72 Stunden führte zu einer etwa zweifachen Abnahme der IC50-Werte für H1299- und MCF-7-Zelllinien und zu einer mehr als dreifachen Abnahme für SK-HEP-1-Zellen.

Lebensfähigkeit von H1299- (a), MCF-7- (b) und SK-HEP-1-Zellen (c) nach 24-stündiger Behandlung mit unterschiedlichen Konzentrationen (0–100 µg/ml) der Fraktion R-S5-C1-H1, 48 Stunden und 72 Stunden. Die Werte werden als Mittelwert ± SEM von drei unabhängigen Experimenten ausgedrückt; Unterschiede wurden bei p ≤ 0,05 (*) und p ≤ 0,001 (**) als signifikant angesehen.

Bei der Betrachtung unter einem Lichtmikroskop zeigten mit R-S5-C1-H1 behandelte H1299-, MCF-7- und SK-HEP-1-Zellen eine deutliche Zellschrumpfung und einen Verlust der Adhärenz, während die Zellen auch abgerundet und unregelmäßig waren und raue Oberflächen (Abb. 3a–c ii–iv). Im Gegensatz dazu waren unbehandelte Kontrollen für alle drei Zelllinien anhaftend und zeigten glatte Oberflächen (Abb. 3a – ci). Deutlichere morphologische Veränderungen wurden beobachtet, wenn die Zellen einer längeren Behandlung ausgesetzt wurden, was mit den Ergebnissen des Zelllebensfähigkeitstests übereinstimmt.

Lichtmikroskopische Beobachtung morphologischer Veränderungen, angezeigt durch rote Pfeile, in H1299- (a), MCF-7- (b) und SK-HEP-1-Zellen (c), die mit 12,5 µg/ml (iv) und 25 µg/ml behandelt wurden ( ii und iii) von R-S5-C1-H1 für 24 h (ii), 48 h (iii) und 72 h (iv). Unbehandelte Kontrollzellen schienen anhaftend und hatten glatte Oberflächen (i).

Um die Fähigkeit von R-S5-C1-H1 zu untersuchen, den apoptotischen Zelltod in H1299-, MCF-7- und SK-HEP-1-Zellen auszulösen, wurden die Fluoreszenzfarbstoffe Hoechst 33342 und Annexin V verwendet. Hoechst 33342, ein DNA-bindender Farbstoff, wurde zum Nachweis der Kernkondensation und -fragmentierung verwendet, die Hauptmerkmale der Apoptose sind. Unterdessen bindet Annexin V, ein 36 kDa großes Kalzium-bindendes Protein, an Phosphatidylserin (PS), das während der Apoptose von der inneren Plasmamembran zur äußeren Zelloberfläche transloziert wird. Wie in Abb. 4 gezeigt, wurde Apoptose in allen drei Krebszelllinien nach 48-stündiger Behandlung mit dem IC50 von R-S5-C1-H1 beobachtet. Morphologische Veränderungen, nämlich Kernkondensation und PS-Externalisierung, wurden durch Hoechst 33342-Färbung (blau) bzw. Annexin V-Färbung (grün) aufgedeckt. Die behandelten Zellen zeigten leuchtend blaue apoptotische Kerne (Abb. 4a – c iii) und grüne Fluoreszenz (Abb. 4a – c iv), während in der unbehandelten Kontrollgruppe die meisten Zellkerne eine schwache homogene Blaufärbung aufwiesen (Abb. 4a – ci). ) und Fehlen grüner Fluoreszenz (Abb. 4a – c ii).

Morphologische Veränderungen in apoptotischen H1299- (a), MCF-7- (b) und SK-HEP-1-Zellen (c) nach 48-stündiger Behandlung mit IC50 von R-S5-C1-H1, beobachtet durch Fluoreszenzmikroskopie. Hoechst 33342-Färbung (blau) und Annexin V-Färbung (grün) wurden zum Nachweis apoptotischer Zellen in unbehandelten Kontrollgruppen (i und ii) und Behandlungsgruppen (iii und iv) verwendet. Rote Pfeile zeigen die Kernkondensation an (hellblau), während gelbe Pfeile die Externalisierung von Phosphatidylserin anzeigen.

Die Hauptkomponentenanalyse (PCA), eine unbeaufsichtigte Mustererkennungstechnik, wurde verwendet, um die Datenverteilung zu überprüfen und Ausreißer während der Analyse zu identifizieren. Für unpolare Metabolome, die im positiven Ionisationsmodus profiliert wurden, zeigte PCA deutliche Unterschiede zwischen Behandlungs- und Kontrollgruppen für H1299-, MCF-7- und SK-HEP-1-Zellen nach 48-stündiger Behandlung mit dem IC50 von R-S5-C1-H1 ( Abb. 5a–ci). Im negativen Ionisierungsmodus waren die Metabolome der Behandlungs- und Kontrollgruppen der drei profilierten Zelllinien jedoch gemeinsam geclustert, was darauf hinweist, dass die profilierten Metabolome keine signifikanten Unterschiede aufwiesen. Daher wurden diese Daten von der Analyse ausgeschlossen (Daten nicht gezeigt). Als nächstes wurden die Zellmetaboliten, die nach der R-S5-C1-H1-Behandlung die größten Veränderungen zeigten, mithilfe von S-Plots identifiziert (Abb. 5a – c ii). Die S-Plots wurden erstellt, indem die Behandlungs- und Kontrollgruppen jeder Zelllinie mittels orthogonaler Projektion und latenter Strukturdiskriminanzanalyse (OPLS-DA) verglichen wurden. Die Werte der Parameter R2Y und Q2 wurden verwendet, um die Qualität des Modells zu beschreiben und die Anpassungsgüte (R2Y) und Vorhersagbarkeit (Q2) des Modells darzustellen. Die Parameter jedes Modells sind in der Ergänzungstabelle S1 aufgeführt. In jedem der S-Diagramme stellt das Streudiagramm p[1] die Größe jeder Variablen innerhalb eines Modells dar, während p(corr)[1] die Zuverlässigkeit jeder Variablen darstellt (modellierte Korrelation). Die am stärksten veränderten Variablen werden entweder unten links oder oben rechts im S-Diagramm dargestellt, und beide korrelieren stark mit der Gruppentrennung. In dieser Studie wurden die Verbindungen unten links und oben rechts in den S-Diagrammen als potenziell relevante Metaboliten ausgewählt, die infolge der R-S5-C1-H1-Behandlung verändert wurden, basierend auf dem ap(corr)[1]-Grenzwert von 0,8. Diese Verbindungen sind gemäß Abb. 5a – c ii gekennzeichnet. Die Gültigkeit des OPLS-DA-Modells wurde durch einen Permutationstest nachgewiesen (Abbildung S2). S-Plots (Abb. 5a–c ii) und Heatmap-Analyse (Abb. 6) zeigten unterschiedliche metabolische Profile für Kontroll- und Behandlungsgruppen, was darauf hindeutet, dass R-S5-C1-H1 die Konzentrationen unpolarer (hauptsächlich Lipid) verändert. Stoffwechselprodukte in den Zellen. Selbst zwischen den Krebszelllinien wirkte sich R-S5-C1-H1 unterschiedlich auf die Metaboliten aus. Im Allgemeinen waren Membranlipide wie Phosphatidylcholine (PC), Phosphorylethanolamine (PE) und Sphingomyeline (SM) in Zellen, die 48 Stunden lang mit dem IC50 von R-S5-C1-H1 behandelt wurden, fehlreguliert. Im Gegensatz dazu wurde festgestellt, dass Triacylglycerine (TGs), die wichtigsten Lipide, die zur Energiespeicherung in Zellen verwendet werden, und Ceramid (Cer), ein Apoptose-Induktor, in den behandelten H1299-, MCF-7- und SK-HEP-1-Zellen hochreguliert sind. Einzelheiten zu den identifizierten hydrophoben Metaboliten, die von der Behandlung mit R-S5-C1-H1 betroffen sind, sind in den Tabellen S4–S6 zusammengefasst. Eine Übersicht über die Stoffwechselwege in den mit R-S5-C1-H1 behandelten Zelllinien ist in Abb. 7 dargestellt.

Hauptkomponentenanalyse (PCA) (i) und S-Plots (ii), abgeleitet aus den Kontroll- und behandelten unpolaren Metabolomen der analysierten H1299- (a), MCF-7- (b) und SK-HEP-1-Zellen (c). im positiven Ionisationsmodus. Finsternisse zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung der Probenreplikate. Für die PCA stellen rote Punkte die Metaboliten der Kontrollgruppe dar, während grüne Punkte die Metaboliten der Behandlungsgruppe (IC50 R-S5-C1-H1, 48 h) darstellen. Die markierten Metaboliten sind die deutlich gestörten Metabolome in den S-Plots.

Heatmap-Analyse der extrahierten unpolaren Metabolome von H1299- (a), MCF-7- (b) und SK-HEP-1-Zellen (c), analysiert im positiven Ionisationsmodus. Gruppen werden oben auf jeder Karte durch Rot (Kontrolle, n = 6) und Grün (Behandlung [IC50 R-S5-C1-H1, 48 h], n = 6) angezeigt. Die Karten zeigen 50 der am stärksten gestörten unpolaren Metaboliten basierend auf euklidischen Abständen und Ward-Clusterbildung. Die Zeilen stellen Metaboliten dar, während die Spalten die Proben darstellen. Die Metabolitenkonzentrationen werden auf einer logarithmischen Skala dargestellt. Der Maßstabsbalken stellt die normalisierte Intensität der Features dar. Verminderte und erhöhte Metaboliten werden in Blau bzw. Rot angezeigt.

Übersicht über die Stoffwechselwege in Zelllinien 48 Stunden nach der Behandlung mit der E.indica-Wurzelfraktion R-S5-C1-H1. SM-Sphingomyelin, PC-Phosphatidylcholin, LPC-Lysophosphatidylcholin, PE-Phosphatidylethanolamin, PS-Phosphatidylserin, TG-Triacylglycerid, DG-Diacylglycerid, Cer-Ceramid, GlcCer-Glucosylceramid. Die Figur wurde mit BioRender.com erstellt.

Sekundäre Pflanzenmetabolite bestehen aus zahlreichen chemischen Verbindungen, darunter Phenole, Alkaloide, Saponine, Terpene, Lipide und komplexe Kohlenhydrate, und werden von Pflanzenzellen über verschiedene Stoffwechselwege produziert. Diese Wege leiten sich von primären Stoffwechselwegen ab und beinhalten sekundäre Modifikationen wie Desaminierung. Es wurde berichtet, dass sekundäre Metaboliten antibiotische, antimykotische und antivirale Aktivitäten ausüben, um Pflanzen vor einer Vielzahl pathogener Invasionen zu schützen. Diese Verbindungen besitzen auch andere wichtige biologische Eigenschaften, darunter entzündungshemmende, antibakterielle, antioxidative und selektive Antikrebsaktivitäten30,36, die eine wissenschaftliche Grundlage für die Verwendung von Heilpflanzen in der traditionellen Medizin bilden.

In dieser Studie wurde die Wirkung der aktivsten Fraktion des E. indica-Wurzelextrakts, R-S5-C1-H1, auf die Lebensfähigkeit von H1299-, MCF-7- und SK-HEP-1-Zellen mithilfe von MTT-Assays bewertet. Es wurde festgestellt, dass R-S5-C1-H1 die Lebensfähigkeit aller untersuchten Krebszelllinien dosis- und zeitabhängig beeinflusst, was mit anderen Studien übereinstimmt, in denen die Antikrebsaktivität von E. indica33,34 in verschiedenen Zelllinien untersucht wurde. 72 Stunden nach der Behandlung lagen die R-S5-C1-H1-IC50-Werte für alle drei Krebszelllinien unter 20 µg/ml. Dies deutet darauf hin, dass R-S5-C1-H1 gemäß den vom US National Cancer Institute und dem Geran-Protokoll festgelegten Kriterien hochaktiv gegen die getesteten Zelllinien war (wobei IC50 ≤ 20 µg/ml = hochaktiv, IC50 21–200 µg/ml). ml = mäßig aktiv, IC50 201–500 µg/ml = schwach aktiv und IC50 ≥ 501 µg/ml = nicht aktiv37). Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch höhere Konzentrationen von R-S5-C1-H1 oder durch längere Behandlungszeiten deutlich verringert. Eine Verlängerung der Behandlungszeit bei gleichzeitiger Reduzierung der Arzneimitteldosis kann eine sinnvolle Möglichkeit sein, unerwünschte Nebenwirkungen möglicherweise zu minimieren. Ein ähnlicher Ansatz wurde in einer klinischen Studie von Bishnoi et al. angewendet. (2017) zu rezidivierendem, fortgeschrittenem und metastasiertem Krebs; Eine Senkung der chemotherapeutischen Dosierung, aber eine Verlängerung der Therapie, um die gewünschten Ergebnisse zu erzielen, verlängerte das Überleben der Patienten und reduzierte gleichzeitig unerwünschte Nebenwirkungen wie Übelkeit, Neuropathie, Müdigkeit, Sepsis und Thrombozytopenie38. Ähnliche Ergebnisse wurden für fortgeschrittene Krebsarten berichtet, wobei durch die Anwendung dieses Therapieansatzes eine verbesserte Lebensqualität erzielt wurde39,40,41.

Krebs wird als fehlregulierte Zellproliferation in Kombination mit unterdrücktem programmiertem Zelltod definiert42. Antikrebsmittel, die den programmierten Zelltod in Krebszellen, insbesondere Apoptose, auslösen können und gleichzeitig unerwünschte Auswirkungen auf die umgebenden normalen Zellen minimieren, haben große Aufmerksamkeit erhalten, da sie eine vielversprechende Strategie für die Krebsprävention und -behandlung bieten43. Die meisten derzeit klinisch eingesetzten Chemotherapeutika hemmen das Zellwachstum und induzieren Apoptose44. Die zelluläre Apoptose ist durch eine Reihe typischer morphologischer Ereignisse gekennzeichnet, darunter Membranbläschen, Zellschrumpfung, Chromatinkondensation, Kernfragmentierung, Fragmentierung in membrangebundene apoptotische Körper und Translokation von Membran-PS45,46. Die mikroskopische Analyse in der vorliegenden Studie zeigte Chromatinkondensation, Kernfragmentierung und Bindung des Annexin-V-Farbstoffs an PS auf dem äußeren Blättchen der Plasmamembran in den behandelten Zellen, was darauf hindeutet, dass R-S5-C1-H1 in der Lage war, den apoptotischen Zelltod auszulösen . Es sind jedoch weitere Studien erforderlich, um den zugrunde liegenden Mechanismus der durch E. indica induzierten Apoptose aufzuklären.

Laut der Metabolomanalyse in dieser Studie wurden mehrere wichtige unpolare Lipidmetaboliten in den Krebszellen durch die Behandlung mit R-S5-C1-H1 beeinflusst. Bei der Extraktion des polaren Metaboloms werden jedoch Rückstände aus dem Kulturmedium (bestehend aus polaren Verbindungen, Nährstoffen und Aminosäuren) während des Prozesses des Schnellgefrierens und der Extraktion eingeschlossen. Obwohl die Konzentrationen dieser Rückstände niedrig sein können, können sie erhebliche Artefakte in die Profilierung des polaren Metaboloms auf zellulärer Ebene einbringen. Daher können bei polaren Metaboliten Unterschiede zwischen Kontrollgruppen und mit E. indica behandelten Gruppen in hohem Maße auf das Kulturmedium und nicht auf das reagierende Metabolom zurückzuführen sein. Im negativen Ionisationsmodus wurde eine Co-Clusterbildung der unpolaren Metabolome der profilierten Behandlungs- und Kontrollgruppe beobachtet, was darauf hindeutet, dass sich die profilierten Metabolome nicht signifikant unterschieden. Daher haben wir uns in der aktuellen Studie auf das unpolare Metabolom im positiven Ionisationsmodus konzentriert. Lipide sind kleine Moleküle mit inhärenten hydrophoben Eigenschaften. Diese Moleküle bilden Schlüsselbestandteile von Membranen, dienen als Energieergänzung und spielen eine Rolle bei der inter- und intrazellulären Signalübertragung sowie bei der Stoffwechselregulation. In eukaryotischen Zellen ist eine Mischung aus komplexen Lipiden wie TGs, Diacylglycerinen (DGs) und Monoacylglycerinen (MGs) vorhanden, die aus Fettacylgruppen (unterschiedlicher Länge und Grad der Ungesättigtheit) bestehen, die mit Glyceringerüsten verestert sind. Bei der ungezielten unpolaren Extraktprofilierung mittels hochauflösender Massenspektrometrie können TGs, DGs und MGs mithilfe positiver Elektrospray-Ionisation durch die Bildung ammoniakhaltiger Adduktionen, d. h. [M+ NH4]+-Ionen, von anderen Lipidklassen unterschieden werden23,47. Die stoßinduzierte Dissoziation (CID) der ammoniakhaltigen Ionen führt zu einer Fülle von Produkt-Ionen, die dem Verlust von Ammoniak plus jeder der Fettacylgruppen als freie Carbonsäure entspricht47,48.

Aufgrund unserer Analyse wurde vermutet, dass die zelluläre Energiehomöostase gestört war, da die TGs deutlich erhöht waren. In vivo ist es möglich, eine Fehlregulation des Energiestoffwechsels durch Analyse der Glukose-, Pyruvat- und Laktatkonzentrationen im Gewebe festzustellen. In vitro stellt die Überwachung kultivierter Zellen, die auf diesen polaren Metaboliten basieren, jedoch tendenziell eine Herausforderung dar, da geringfügige Metabolitenveränderungen durch Nährstoffe oder Zusätze im Kulturmedium verdeckt werden können, was zu falsch positiven Ergebnissen führt. Die Ansammlung von TGs wurde mit zellulärem Stress, einschließlich Apoptose, in Verbindung gebracht49. Li et al. (2018) schlugen vor, dass Zellen, die chemisch induziertem oxidativem Stress oder Apoptose ausgesetzt sind, TGs (mit mehrfach ungesättigten Fettacylketten) nutzen, um sich vor Toxizität zu schützen und den Zelltod zu begrenzen49. Dieses Phänomen könnte die Hochregulierung von TGs in allen drei Krebszelllinien nach der Behandlung mit R-S5-C1-H1 in der vorliegenden Studie erklären. Mitochondriale Dysfunktion und Hemmung der Lipidbiosynthese führen schließlich dazu, dass Zellen Apoptose durchlaufen50.

Diacylglycerine spielen eine wichtige Rolle als sekundäre Botenstoffe und aktivieren Proteine, die an verschiedenen Signalkaskaden beteiligt sind. Daher ist die Anreicherung in biologischen Systemen streng reguliert51. Die Phosphorylierung von DGs zur Bildung von Phospholipiden über Diacylglycerinkinase führt zu einer Abschwächung der DG-Spiegel in der Zellmembran, wodurch die Verfügbarkeit von intrazellulärem DG-Signalprotein verändert und Zellwachstum, -transport, -differenzierung und -migration reguliert werden51. Während der Phospholipidsynthese wird Phosphocholin/Phosphoethanolamin durch Phosphotransferase von Cytidindiphosphat (CDP)-Cholin/Ethanolamin auf DGs übertragen, wodurch Phosphatidylcholin (PC)/Phosphatidylethanolamin (PE) entsteht52. Phosphatidylcholine machen fast 50 % der Glycerophospholipid-Spezies in eukaryontischen Zellen aus. Die Fülle dieser Phospholipide unterstreicht ihre Bedeutung in biologischen und zellulären Systemen als Bestandteile der Membrandoppelschicht oder als sekundäre Botenstoffe. Phosphorylcholinhaltige Lipidspezies werden von anderen Phospholipidklassen durch positive Elektrospray-Ionisation unterschieden, wobei die CID der protonierten Ionen ein reichlich vorhandenes Produkt-Ion, m/z 184, ergibt, das einer Phosphorylcholin-Kopfgruppe entspricht, die an der sn-3-Position des Glycerinrückgrats gebunden ist und Fettacylsubstituenten an sn-1 und/oder sn-223,53. Mittlerweile ist PE, ein Aminophospholipid, nach PC54 das zweithäufigste Phospholipid in Säugetiermembranen. Es konzentriert sich auf das dem Zytosol zugewandte Blatt der Zellmembran, während phosphorylcholinhaltige Lipide (einschließlich PC und SM) in der äußeren Plasmamembran lokalisiert sind55. Phosphatidylethanolamin spielt eine wichtige Rolle bei posttranslationalen Modifikationen, beeinflusst die Membrantopologie und fördert die Membranfusion von Zellen und Organellen, die oxidative Phosphorylierung, die mitochondriale Biogenese und die Autophagie56. Phosphorylethanolamin-Spezies unterscheiden sich von anderen Phospholipidklassen durch die CID der protonierten Ionen und ergeben ein reichlich vorhandenes Tochterion, [M+ H-141]+, mit Neutralverlust von m/z 141, entsprechend der an der sn-3 gebundenen Phosphorylethanolamin-Kopfgruppe Position57. Die Hemmung des CDP-Cholin-Signalwegs ist ein häufiges Merkmal der Apoptose58, während eine Störung der PC-Spiegel zur Auslösung des apoptotischen Zelltods führt, unabhängig von den PC-Syntheseschritten, die beeinträchtigt sind59. Unsere Analyse ergab, dass die DG-, PC- und PE-Spiegel in den behandelten Zellen erheblich gestört waren, was darauf hindeutet, dass R-S5-C1-H1 durch Modifizierung der Phospholipidsynthese Apoptose induzieren könnte.

Sphingolipide, amphipathische Lipide mit unterschiedlichen molekularen Strukturen und Funktionen, fungieren als Schlüsselregulatoren für das Überleben und Absterben von Krebszellen60. Diese Moleküle enthalten alle eine langkettige (sphingoide) Base (aliphatischer Aminoalkohol), die aus einem langen Kohlenwasserstoffschwanz mit Hydroxylgruppen an den Positionen sn-1 und sn-3 und einer Amingruppe an sn-2 besteht. Zu den Funktionen, die bioaktiven Sphingolipiden zugeschrieben werden, gehören Zellwachstum, Zelltod, Seneszenz, Entzündung, Immunreaktionen, Nährstoffaufnahme, Stoffwechsel, Reaktionen auf Stressreize und Autophagie61,62. Die stoßinduzierte Dissoziation protonierter Cer-Spezies erzeugt ein einzigartiges Fragment mit m/z 264, das dem Sphingosin-Rückgrat (d18:1) entspricht, wohingegen Dihydroceramid (d18:0) und Sphingadienin (d18:2) Fragmente mit m/z 266 beisteuern bzw. 262.

Ceramide sind zentrale Moleküle im Sphingolipid-Stoffwechsel und bestehen aus einem Sphingosin-Rückgrat und einer langen Fettsäurekette (mit unterschiedlicher Länge von C14 bis C26), die über Amidbindungen an den zweiten Kohlenstoff des Rückgrats gebunden ist. Sie dienen als metabolische und strukturelle Vorläufer für komplexe Sphingolipide (die hydrophile Kopfgruppen enthalten) wie SM, Ceramid-1-phosphat und kohlenhydratkonjugiertes Cers63. Die Regulierung von Cer wird durch komplexe und integrierte Stoffwechselwege aufrechterhalten, an denen spezialisierte Enzyme beteiligt sind63. Sphingomyelinase (SMase) ist ein Enzym, das SM zu Cer im Zytoplasma bzw. Golgi-Apparat hydrolysiert64, während die Cholin-Kopfgruppe an DG gebunden wird, um PC zu bilden. Es wurde berichtet, dass Cer de novo aus dem gemeinsamen Sphinganin-Rückgrat (d18:0) synthetisiert wird65. Das ungesättigte Sphingosin-Rückgrat (d18:1 oder d18:2) verstärkt die intermolekulare Wasserstoffbindung im Polarbereich und sorgt so für eine engere Packung der Cer-Moleküle in der Zellmembran62. Wichtig ist, dass Cer die Fähigkeit besitzt, Kanäle in den äußeren Mitochondrienmembranen aufzubauen, um die Freisetzung von Cytochrom C für die Caspase-9-Aktivierung zu fördern, was zur Apoptose führt66,67. Es wurde festgestellt, dass Cer proapoptotisch ist und seine Erzeugung dem Beginn der apoptotischen Signalübertragung vorausgeht68. Es wurde gezeigt, dass viele apoptotische Reize, darunter zellulärer Stress und zytotoxische Medikamente, den endogenen Cer-Spiegel über mehrere Mechanismen erhöhen68, einschließlich der Hemmung von Cer-Stoffwechselenzymen69. Im Gegensatz dazu kommt SM aufgrund des Transports von Cer aus dem endoplasmatischen Retikulum hauptsächlich im Golgi-Apparat70 vor. Bei der Ankunft im Golgi-Apparat wird Cer über das Enzym Sphingomyelin-Synthase (SMS) in SM umgewandelt, was Zellproliferation, -migration und -überleben induzieren kann72. Der SM-Metabolismus spielt eine Rolle beim Fortschreiten des Krebses, wobei der Abbau von SM direkt zur Cer-Produktion führt73. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Glucosylceramid (GlcCer), ein überlebensförderndes und antiapoptotisches Molekül, das durch die Übertragung von Glukose auf Cer durch Glucosylceramid-Synthase (GCS) entsteht, mit der Resistenz gegen mehrere Arzneimittel in Krebszellen verbunden ist69. Cers können auch durch den Abbau von GlcCers durch das Enzym Glucocerebrosidase (GCase)74 entstehen. Es wurde vermutet, dass der intrazelluläre Cer-Pool die proliferativen und antiapoptotischen Wirkungen von GlcCer beeinflusst, wobei eine Steigerung der GlcCer-Synthese den Cer-Spiegel in den Zellen senkt75. In dieser Studie war der Cer-Spiegel in den mit R-S5-C1-H1 behandelten Krebszellen im Allgemeinen im Vergleich zu den Kontrollen erhöht, wohingegen der SM- und GlcCer-Spiegel nach der Behandlung verringert war. Diese Ergebnisse legen nahe, dass R-S5-C1-H1 in den untersuchten Krebszellen Apoptose induzieren kann, indem es das Gleichgewicht wichtiger Sphingolipide durch Auswirkungen auf den Sphingolipid-Metabolismus stört.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass R-S5-C1-H1 die Lebensfähigkeit von H1299-, MCF-7- und SK-HEP-1-Zellen dosis- und zeitabhängig beeinflusste. Es löste auch den apoptotischen Zelltod in den behandelten Zellen aus. Die auf LC-MS basierende Metabolomik zeigte, dass R-S5-C1-H1 in den getesteten Krebszelllinien unterschiedliche Stoffwechselreaktionen im Zusammenhang mit Schädigung und Verjüngung hervorrief. Eine Hochregulierung von TGs deutet auf einen Schutz der Zellen vor R-S5-C1-H1-Exposition hin, während eine Störung der PC- und PE-Spiegel auf die Induktion von Apoptose durch R-S5-C1-H1 durch Modulation der Phospholipidsynthese hinweisen könnte. Dysreguliertes SM und erhöhte Mengen an Cer-Spezies deuten ebenfalls auf die Einleitung der Apoptose hin, da diese amphipathischen Lipide für die Freisetzung proapoptotischer Proteine ​​aus den Mitochondrien verantwortlich sind. Daher konnten wir durch unvoreingenommenes Profiling mit hohem Durchsatz gleichzeitig nach Unterschieden bei mehreren Metaboliten suchen. Diese Methode hat gegenüber herkömmlichen Methoden zur Analyse der Wirkung therapeutischer Interventionen Vorteile, da sie das Gesamtverständnis molekularer Vorgänge erleichtern kann.

Wildes E. indica wurde im Tiefland von Kota Belud (Breitengrad 6,290833°N und Längengrad 116,424722°E), Sabah, Malaysia, gemäß dem Sabah Wildlife Conservation Enactment 1997 gesammelt. Die Pflanze wurde von Herrn Julius Kulip vom Institut identifiziert für Tropenbiologie und Naturschutz, Universiti Malaysia Sabah, und ein Belegexemplar (BORH 2263) wurde im Borneensis Herbarium des Instituts für Tropenbiologie und Naturschutz, Universiti Malaysia Sabah, Kota Kinabalu, Malaysia, hinterlegt.

Die gesammelten Pflanzenproben wurden gründlich gereinigt und bei -20 °C gelagert, bevor sie mit einem Labconco-Gefriertrockner (Labconco, Kansas City, MO, USA) gefriergetrocknet wurden. Gefriergetrocknete E. Indica wurde mit einem Hochleistungsmixer gemahlen. Die homogenisierte Probe wurde dann mit einer modifizierten Extraktionsmethode23 erschöpfend extrahiert, wobei ein optimiertes Verhältnis von 1:1:1 (v/v/v) doppelt destilliertem Wasser (Milli-Q-System (Merck, Darmstadt, Deutschland) bei einem spezifischen Widerstand verwendet wurde von > 18,2 MΩ-cm/Methanol (MeOH)/Chloroform wurde verwendet. Anschließend wurde die untere Schicht der Mischung entfernt und im Vakuum konzentriert, um einen halbfesten Rohextrakt zu erhalten.

Rohextrakte der verschiedenen Pflanzenteile (Samen, Stängel, Blätter und Wurzeln) wurden auf ihre Verwendung zur Behandlung der Zelllinien H1299, MCF-7 und SK-HEP-1 untersucht. Basierend auf dem Rohextrakt-Screening (Abb. S1a) wurde der Wurzelextrakt, der die höchste Aktivität gegen alle Zelllinien aufwies, für die Festphasenextraktion (SPE) ausgewählt. Zur Reinigung des Extrakts wurde eine OASIS HLB-Cartridge-SPE-Säule gemäß dem in Tabelle S2 angegebenen Lösungsmittelgemisch verwendet. Beim SPE-Screening war R-S5 die aktivste Fraktion (Abb. S1b); Dies wurde dann einer Normalphasen-Offensäulenchromatographie in mit Kieselgel gepackten Säulen mit einer Maschenweite zwischen 0,063 und 0,200 mm (Merck, Darmstadt, Deutschland) unterzogen. Die Elution wurde mit Hexan:Ethylacetat (9:1, Vol./Vol.) begonnen und mit MeOH abgeschlossen (Tabelle S3). Die aktivste Fraktion, R-S5-C1 (Abb. S1c), wurde mit dem HPLC-System der Agilent 1200-Serie (Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland) in Verbindung mit einer Thermo Scientific Accucore C18-Säule (2,1 mm × 150 mm × 2,6 mm) weiter getrennt µm; Sunnyvale, CA, USA). Die mobile Phase A bestand aus einer Mischung aus entionisiertem Wasser mit 0,1 % Ameisensäure und 1 % Ammoniumacetat (NH4CH3CO2), während die mobile Phase B aus einer Mischung aus Acetonitril und MeOH (6:4 v/v) mit 0,1 % Ameisensäure und bestand 1 % NH4CH3CO2. Der Elutionsgradient wurde so programmiert, dass er in 7 Minuten linear von 1 auf 70 % Lösungsmittel B ansteigt, gefolgt von 100 % Lösungsmittel B von 7,1 auf 10 Minuten und 3 Minuten lang beibehalten wird. Später wurde die Säule vor der nächsten Probeninjektion 1 Minute lang mit dem anfänglichen Gradienten konditioniert. Den Ergebnissen des abschließenden Screenings zufolge war R-S5-C1-H1 die aktivste Fraktion gegen alle Zelllinien (Abb. S1d) und wurde daher für weitere Analysen ausgewählt. R-S5-C1-H1 wurde vor allen Zellexperimenten vollständig in Dimethylsulfoxid (DMSO) suspendiert, mit einer Endkonzentration von DMSO ≤ 0,1 % (v/v).

Die Zelllinien des nichtkleinzelligen Lungenkarzinoms H1299 (ATCC CRL-5803™), des hepatozellulären Karzinoms SK-HEP-1 (ATCC HTB-52™) und des Brustadenokarzinoms MCF-7 (ATCC HTB-22™) wurden von dem Amerikaner erworben Typkultursammlung (Manassas, VA, USA). SK-HEP-1-Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium gehalten, während die anderen Zelllinien in Roswell Park Memorial Institute 1640-Medium kultiviert wurden. Alle Medien wurden mit 10 % fötalem Rinderserum (Tico Europe, Amstelveen, Niederlande) und 1 % Penicillin-Streptomycin (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) ergänzt. Die Zellen wurden in einer feuchten Umgebung mit 5 % CO2 bei 37 °C gezüchtet.

Die Lebensfähigkeit von H1299-, MCF-7- und SK-HEP-1-Zellen wurde mithilfe des kolorimetrischen [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid] (MTT)-Assays (Nacalai Tesque) bewertet , Kyoto, Japan). Kurz gesagt, die Zellen wurden mit 5 × 103 Zellen/Well (100 μl) auf einer 96-Well-Platte (Nunc, Thermo Fisher Scientific, Dänemark) ausgesät und 24 Stunden lang inkubiert, um die Zellanhaftung zu ermöglichen. Nach 24 Stunden wurden die Zellen 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden lang mit unterschiedlichen Konzentrationen von R-S5-C1-H1 im Bereich von 0,05 bis 100 μg/ml behandelt. Als Positivkontrolle diente Doxorubicin (0,01 bis 100 μg/ml). Der Formazan-Niederschlag in jeder Vertiefung wurde in DMSO suspendiert und die Absorption wurde bei 570 nm mit dem Mikroplatten-Lesegerät Tecan Infinite 200 Pro (Männedorf, Schweiz) gemessen. Die prozentuale Lebensfähigkeit der Zellen (%) wurde als \(\frac{Absorption\, von\, Probe}{Absorption\, von\, Kontrolle}\times 100\%\ berechnet. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt und die Daten wurden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Statistisch signifikante Unterschiede bei einem Signifikanzniveau von p ≤ 0,05 wurden mithilfe des t-Tests ermittelt (*p ≤ 0,05; **p ≤ 0,001).

Alle Zellen wurden mit 2,5 × 105 Zellen/Well (500 µL) in einem 4-Well-µ-Objektträger (ibidi, Martinsried, Deutschland) ausgesät und über Nacht inkubiert, bevor sie 48 Stunden lang mit dem IC50 von R-S5-C1-H1 behandelt wurden . Behandelte Zellen wurden gleichzeitig mit Hoechst 33342 bei 1 μg/ml (Sigma, USA) und Annexin V bei 10 μg/ml (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) bei 37 °C für 30 Minuten im Dunkeln fixiert und gefärbt. Morphologische Beobachtungen wurden unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops, BX 53 (Olympus, Tokio, Japan), durchgeführt, um Kernkondensation und PS-Externalisierung mit ultravioletten bzw. grünen Fluoreszenzfiltern (Olympus, Tokio, Japan) sichtbar zu machen.

Jede Zelllinie wurde mit 1 × 106 Zellen/Schale in 12 Kulturschalen ausgesät. Sechs Schalen jeder Zelllinie wurden 48 Stunden lang mit dem IC50 von R-S5-C1-H1 behandelt, während die restlichen sechs Schalen als unbehandelte Kontrollen dienten. Das Kulturmedium aus jeder Kulturschale wurde gesammelt und bei 1500 g zentrifugiert, um ein Zellpellet zu erhalten. Anhaftende Zellen wurden mit vorgekühltem MeOH in HPLC-Qualität eingefroren, durch Schaben gesammelt und dann zusammen mit den Zellpellets aus dem vorherigen Schritt in saubere Einweg-Borosilikatröhrchen überführt. Die kombinierten Zellen wurden unter Verwendung eines modifizierten Bligh- und Dyer-Extraktionsprotokolls65 extrahiert. Kurz gesagt, die Zellen wurden gründlich mit 4 ml MeOH/Chloroform (1:1 v/v), gefolgt von 2 ml 0,05 M Natriumchlorid, gemischt und 30 Minuten lang bei 1500 g und 4 °C zentrifugiert. Sowohl polare als auch unpolare Zellextrakte wurden getrennt übertragen und mit einem Schnellvakuumkonzentratorsystem (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) verdampft, bevor sie bei –80 °C gelagert wurden. Vor der LC-MS/MS-Analyse wurden die Zellextrakte in 1,2 ml MeOH erneut gelöst. Jeder Zellextrakt wurde dreifach profiliert, um die Konsistenz des Instruments sicherzustellen.

Die Profilierung des Zellextrakts wurde nach einer zuvor entwickelten Methode76,77 durchgeführt. Kurz gesagt, 10 μl oder 30 μl Extrakt wurden auf ein Vanquish-UHPLC-System (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) aufgetragen, das mit dem ultrahochauflösenden Qq-Flugzeit-Massenspektrometer Impact II (Bruker, Billerica, MA) gekoppelt war , USA) im positiven bzw. negativen Elektrospray-Ionisationsmodus. Eine Pentafluorphenylsäule, Kinetex F5 (2,1 mm × 100 mm × 2,6 µm; Phenomenex, Torrance, Kalifornien, USA), wurde für die chromatographische Trennung bei 35 °C verwendet und die Flussrate der mobilen Phase wurde bei 0,6 ml/min gehalten. Die mobile Phase A bestand aus einer Mischung aus entionisiertem Wasser mit 0,1 % Ameisensäure und 1 % NH4CH3CO2, und die mobile Phase B bestand aus einer Mischung aus Acetonitril und MeOH (6:4 v/v) mit 0,1 % Ameisensäure und 1 % NH4CH3CO2. Die Gradientenelution wurde so programmiert, dass sie in 7 Minuten linear von 1 auf 70 % Lösungsmittel B ansteigt, gefolgt von 100 % Lösungsmittel B von 7,1 auf 10 Minuten und 3 Minuten lang beibehalten wird. Anschließend wurde die Säule 1 Minute lang mit dem anfänglichen Gradienten konditioniert, bevor die nächste Probe eingeführt wurde. Die Datenerfassung wurde zwischen m/z 50 und 1500 eingestellt, während positive und negative Elektrospray-Ionisationsspannungen auf 3,5 kV bzw. –3,5 kV eingestellt wurden. Die Temperatur des Ionenquellengases wurde auf 325 °C, der Trocknungsgasfluss auf 10 l/min und der Zerstäuberfluss auf 3 bar eingestellt. Das Massenspektrometer wurde vor der Analyse jeder Charge mit Tune Mix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) kalibriert. Bei jeder Erfassung wurde zwischen 0,1 und 0,3 Minuten ein Massenkalibriermittel, Natriumformiat, eingeführt. Die m/z-Werte des Analyten nach der Erfassung wurden anhand des eingeführten Natriumformiats kalibriert.

Die erfassten Rohdaten wurden mit MZmine 235 vorverarbeitet, um die Variation der Retentionszeiten und m/z-Werte in jeder Analyse auszugleichen. Diese Vorverarbeitungsdaten wurden als Peakliste im CSV-Format (Comma-Separated Values) exportiert, wobei die Zeilen die integrierten und normalisierten Peakflächen und die Spalten die Proben darstellen. Exportierte CSV-Dateien wurden für multivariate Analysen mit Metaboanalyt 5.0 (Version 5.0; http://www.metaboanalyst.ca)78 verwendet. Metabolitenmerkmale mit fehlenden Werten > 50 % wurden entfernt und fehlende Werte wurden standardmäßig durch 1/5 der minimalen positiven Werte der entsprechenden Variablen ersetzt. Die erfassten Datensätze wurden vor multivariablen Analysen logarithmisch transformiert und Pareto-skaliert, um die Datenverteilung zu untersuchen und Ausreißer zu identifizieren. Es wurden multivariate Datenanalysen einschließlich PCA, OPLS-DA und hierarchischer Clusteranalyse (Heatmap) durchgeführt. Anschließend untersuchte das Modell für OPLS-DA interne Beziehungen in Matrix-X-Variablen und Antwortmatrix Y. Die Modellqualität wurde anhand von R2X- oder R2Y-Werten und Q2-Werten geschätzt. Um eine Überanpassung des OPLS-DA-Modells zu vermeiden, wurde für jedes Modell ein zusätzliches Kreuzvalidierungstool (Permutationstest mit 100-mal randomisierten Y-Variablen) durchgeführt. Die Anpassungsparameter für das OPLS-DA-Modell, R2X, R2Y und Q2, wurden berechnet (variierend von 0 bis 1). R2Y und Q2 im permutierten Test beschrieben die Fitness der Daten bzw. die Vorhersagbarkeit des abgeleiteten Modells. Darüber hinaus zeigten die Metabolitenmerkmale (nichtparametrischer t-Test, p < 0,05) und die entsprechenden Fold Changes (Fold Change Schwelle ≥ 2), wie die ausgewählten Differenzialmetaboliten zwischen der Behandlungs- und der Kontrollgruppe variierten; Diese Metaboliten wurden ausgewählt und einem weiteren Verbindungsabgleich und einer weiteren Analyse unterzogen. In der aktuellen Studie konzentrierten sich alle Metabolomics-Datenanalysen nur auf die unpolare Schicht und wurden mit den Datensätzen des positiven Ionisationsmodus durchgeführt, da der negative Ionisationsmodus keine signifikanten Unterschiede aufwies (Daten ausgenommen).

Basierend auf den normalisierten erfassten Daten wurde die statistische Signifikanz durch T-Tests (nichtparametrische Analyse) bestimmt. Die Identifizierung von Metaboliten basierte auf der Erkennung von Ionenfragmentierungsmustern23,79 und dem Abgleich von Fragmentierungsspektren (MS/MS) unter Verwendung von Metfrag80, Human Metabolome Database (HMDB)81 und Lipid Metabolites and Pathway Strategy (LIPIDMAPS)82. Masse-zu-Ladungs-Verhältnisse, ergänzt durch Fragmentierungsspektren und eine akzeptable Massentoleranz (bei 5 ppm), zeigten die Identität des Metaboloms. Darüber hinaus wurde die Bestimmung der Lipid-Molekülformeln durch die Beschreibung von Fettsäuresubstituenten durch mathematische Berechnung der Massenbilanz für das Molekulargewicht auf der Grundlage einer hochauflösenden Massengenauigkeit erreicht.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel (und seiner ergänzenden Informationsdatei) enthalten. Weitere Rohdatendateien sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Diese Arbeit wurde von der Universiti Malaysia Sabah (UMS) im Rahmen der UMSGreat-Forschungsstipendien GUG 0402-2/2019 und GUG 0278-2/2018 unterstützt. Vielen Dank an Herrn Samudi bin Surag und Frau Lim Leong Lui für ihre freundliche Hilfe während der Experimente.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Perng Yang Puah und Dexter Jiunn Herng Lee.

Abteilung für Biomedizinische Wissenschaften, Fakultät für Medizin und Gesundheitswissenschaften, Universität Malaysia Sabah, Jalan UMS, 88400, Kota Kinabalu, Sabah, Malaysia

Perng Yang Puah & Siat Yee Fong

Biotechnologisches Forschungsinstitut, Universität Malaysia Sabah, Jalan UMS, 88400, Kota Kinabalu, Sabah, Malaysia

Dexter Jiunn Herng Lee & Yee Soon Ling

Medizinische Abteilung, Sarawak General Hospital, Jalan Hospital, 93586, Kuching, Sarawak, Malaysia

Soo Huan Puah

Medizinische Abteilung, Seberang Jaya Hospital, Jalan Tun Hussein Onn, Seberang Jaya, 13700, Permatang Pauh, Penang, Malaysia

Soo Huan Puah

Abteilung für Chirurgie, Fakultät für Medizin und Gesundheitswissenschaften, Universität Malaysia Sabah, Jalan UMS, 88400, Kota Kinabalu, Sabah, Malaysia

Nik Amin Sahid Nik Lah

CAIQ Certification Sdn Bhd Kota Kinabalu, Sabah, Malaysia

Yee Soon Ling

Borneo Medical and Health Research Centre, Fakultät für Medizin und Gesundheitswissenschaften, Universiti Malaysia Sabah, Jalan UMS, 88400, Kota Kinabalu, Sabah, Malaysia

Verdammter Yee Fong

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PYP, DJHL, YSL und SYF konzipierten die Experimente, PYP, DJHL und YSL führten Experimente und Datenanalysen durch und schrieben das Manuskript, SHP und NAS trugen zur statistischen Analyse bei und YSL und SYF überwachten die Arbeit und entwarfen die Experimente. Alle Autoren diskutierten die Daten und überprüften das Manuskript.

Korrespondenz mit Yee Soon Ling oder Siat Yee Fong.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Puah, PY, Lee, DJH, Puah, SH et al. Hochdurchsatz-Metabolomik zeigt Fehlregulation hydrophober Metabolome in Krebszelllinien durch Eleusine indica. Sci Rep 12, 9347 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-13575-6

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Eingegangen: 13. Dezember 2021

Angenommen: 18. Mai 2022

Veröffentlicht: 06. Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-13575-6

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