Kisspeptin reguliert die Proliferation und Apoptose von Ovarialgranulosazellen beim polyzystischen Ovarialsyndrom durch Modulation des PI3K/AKT/ERK-Signalwegs

BMC Women's Health Band 23, Artikelnummer: 15 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Entwicklung des polyzystischen Ovarialsyndroms (PCOS) steht in engem Zusammenhang mit Apoptose und oxidativem Stress in den Granulosazellen der Eierstöcke. Kisspeptin spielt eine wichtige Rolle bei der Funktion der Fortpflanzungsorgane. Ziel dieser Studie war es, die Rolle von Kisspeptin bei PCOS und der durch oxidativen Stress ausgelösten Apoptose von Eierstock-Körnerzellen zu untersuchen.

Ein PCOS-Rattenmodell wurde durch die Injektion von Dehydroepiandrosteron (DHEA) und die Fütterung der Ratten mit einer fettreichen Diät etabliert. Die RNA- und Proteinspiegel von Kisspeptin wurden durch quantitative PCR, Western Blot und histologische Färbung analysiert. Der Gewebeschaden wurde mittels Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) bewertet. Die Lebensfähigkeit und Proliferation von humanem Granulosazellen-KGN wurde mit dem Zellzählkit-8 (CCK-8) und dem 5-Ethinyl-2′-desoxyuridin (EdU)-Assay gemessen. Zellzyklus und Apoptose wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert. Der oxidative Stress wurde durch Messung der Werte reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), Malondialdehyd (MDA), Glutathion (GSH), Superoxiddismutase (SOD) und Katalase (CAT) analysiert.

Kisspeptin war in den Ovarialgranulosazellen von PCOS-Ratten im Vergleich zu denen von Kontrollratten herunterreguliert. Die Überexpression von Kisspeptin steigerte die KGN-Zellproliferation und hemmte die Apoptose. Die ROS-Erzeugung wurde durch Kisspeptin unterdrückt, zusammen mit verringerten MDA-Spiegeln und erhöhten Spiegeln der Antioxidantien GSH, SOD und CAT. Kisspeptin aktiviert die PI3K/AKT- und ERK-Signalisierung, und die Inaktivierung von ERK1/2 unterdrückt die Schutzfunktion von Kisspeptin in den Granulosazellen der Eierstöcke.

Kisspeptin verbessert die Proliferation und lindert Apoptose und oxidativen Stress in Ovarialgranulosazellen, indem es die PI3K/AKT- und ERK-Signalisierung aktiviert.

Die Kisspeptin-Expression ist in den Eierstöcken von PCOS-Ratten verringert

Kisspeptin fördert die Proliferation und hemmt die Apoptose von Granulosazellen

Kisspeptin lindert den oxidativen Stress von Granulosazellen

Kisspeptin aktiviert den PI3K/AKT/ERK-Signalweg

Peer-Review-Berichte

Das polyzystische Ovarialsyndrom (PCOS) ist eine häufige endokrine Störung bei Frauen im gebärfähigen Alter [1]. PCOS ist durch ovulatorische Dysfunktion, polyzystische Ovarien und Hyperandrogenismus gekennzeichnet, was zu anovulatorischer Unfruchtbarkeit und kompensatorischer Hyperinsulinämie führt [2]. Patienten mit PCOS zeigen häufig eine erhöhte männliche Hormonsekretion und erhöhte Entzündungswerte [2]. Die spezifische Pathogenese und die Mechanismen von PCOS sind jedoch noch weitgehend unbekannt. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass PCOS mit der Anhäufung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), einer unterdrückten antioxidativen Funktion und erhöhtem oxidativen Stress einhergeht, was auf die entscheidende Rolle von oxidativem Stress in der Pathophysiologie von PCOS hinweist [3, 4]. Darüber hinaus wurde eine verminderte Superoxiddismutase (SOD)-Aktivität in Follikelflüssigkeit und Serum von Patienten mit PCOS beobachtet [5].

ROS entstehen bei mehreren physiologischen Prozessen sowie bei einem Ungleichgewicht zwischen Prooxidantien und Antioxidantien [6]. Antioxidantien wie Glutathion (GSH), SOD und Katalase (CAT) halten die ROS auf einem niedrigen Niveau, um eine normale Zellfunktion sicherzustellen [6]. Darüber hinaus kann eine übermäßige ROS-Anreicherung zu einer mitochondrienbedingten Apoptose führen [7,8,9]. Studien haben gezeigt, dass bei PCOS eine durch oxidativen Stress induzierte Apoptose in Ovarialgranulosazellen auftritt [10, 11]. Es wurde berichtet, dass Apoptose und Funktionsstörungen der Granulosazellen der Eierstöcke eine wichtige Rolle bei der PCOS-Entwicklung spielen [12, 13]. Daher ist die gezielte Bekämpfung von Apoptose und oxidativem Stress in Granulosazellen der Eierstöcke eine plausible Methode für die PCOS-Behandlung.

Kisspeptine sind Neuropeptide, die ursprünglich als Tumorsuppressoren identifiziert wurden, die die Metastasierung von Tumorzellen hemmen [14]. Jüngste Studien haben gezeigt, dass sie eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des Fortpflanzungssystems von Säugetieren spielen, einschließlich des Beginns der Pubertät, der Gonadotropinsekretion, der Geschlechtsdifferenzierung im Gehirn und des Eisprungs, indem sie die Produktion des Gonadotropin-Releasing-Hormons (GnRH) steuern [15, 16]. Es bleibt jedoch unklar, ob Kisspeptin die durch oxidativen Stress induzierte Apoptose von Ovarialgranulosazellen während der PCOS-Progression moduliert.

Diese Studie untersuchte den Zusammenhang zwischen Kisspeptin-Expression und PCOS anhand eines In-vivo-Rattenmodells und bestimmte die Rolle von Kisspeptin bei der Modulation von Proliferation, Apoptose und oxidativem Stress in Ovarialgranulosazellen. Unsere Studie liefert neue Belege für die Funktion von Kisspeptin bei PCOS und präsentiert es als vielversprechende Behandlung für PCOS.

Drei Wochen alte weibliche Sprague-Dawley-Ratten wurden von Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd. (Jinan, China) beschafft und unter Standardhaltungsbedingungen gehalten. Die Ratten wurden zufällig in zwei Gruppen eingeteilt, eine Dehydroepiandrosteron (DHEA)-Gruppe und eine Ölgruppe, mit jeweils fünf Ratten in jeder Gruppe. Den Ratten wurde täglich subkutan DHEA (60 mg/kg in 0,2 ml Sesamöl) injiziert, um PCOS auszulösen, und sie erhielten eine Diät mit 60 % Fett (nach Kalorien) [17]. Den Ratten der Ölgruppe wurde die gleiche Menge Sesamöl injiziert wie der Kontrollgruppe. Nach 20-tägiger Behandlung wurden das Gewicht und die Länge von der Nase bis zum Anus jeder Ratte aufgezeichnet. Der BMI wurde als Körpergewicht (g) dividiert durch das Quadrat der Nase-Anus-Länge (cm) berechnet. Anschließend wurden die Ratten getötet und Eierstockgewebe für nachfolgende Experimente gesammelt. Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien der Ethikkommission für Versuchstiere unseres Krankenhauses durchgeführt.

Die gesammelten Eierstöcke wurden zweimal mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, mit 4 % Paraformaldehyd (Beyotime, China) fixiert, in Paraffin eingebettet und in 5 μm-Scheiben geschnitten. Gewebeproben wurden mit Hämatoxylin und Eosin (Beyotime, China) gefärbt. Die Bilder wurden mit einem Mikroskop (Olympus, Tokio, Japan) aufgenommen.

Um die Expression von Kisspeptin in Eierstockgeweben zu untersuchen, wurden in Paraffin eingebettete Gewebe zur Antigengewinnung auf 98 °C erhitzt, mit Ziegenserum blockiert und über Nacht bei 4 °C mit Anti-Kisspeptin-Antikörper (1:100; Abcam, USA) inkubiert . Die Proteinbanden wurden mit Biotin-markierten Sekundärantikörpern inkubiert und unter Verwendung von DAB-Reagenz (Beyotime, China) sichtbar gemacht. Die Bilder wurden mit einem Mikroskop (Olympus) aufgenommen.

Die menschliche Ovarial-Granulosa-Zelllinie KGN wurde von Procell (Wuhan, China) erworben. Die Zellen wurden in DMEM/F12-Medium (Hyclone, USA), das 10 % FBS (Hyclone) und 1 % Penicillin/Streptomycin enthielt, bei 37 °C in einem mit 5 % CO2 gefüllten Inkubator kultiviert.

Der Kisspeptin-überexprimierende Vektor (KISS-1), die auf Kisspeptin gerichtete shRNA (shRNA-1 und shRNA-2) und die durcheinandergemischte shRNA-Kontrolle wurden von GenePharma erhalten. Ltd. (Shanghai, China). KGN-Zellen wurden in Platten mit 6 Vertiefungen ausplattiert und mit den angegebenen Vektoren oder shRNA unter Verwendung von Lipofectamine 3000 (Invitrogen, USA) transfiziert. Um den ERK-Signalweg zu hemmen, wurden KGN-Zellen 24 Stunden lang mit dem ERK1/2-Antagonisten PD98059 (5 μM; Selleck, USA) behandelt.

Transfizierte Zellen wurden in einer Platte mit 96 Vertiefungen mit 5000 Zellen pro Vertiefung platziert. Nach 0, 24, 48 und 72 Stunden Inkubation wurden 20 μl CCK-8-Reagenz (Beytime, China) in jede Vertiefung gegeben und weitere 2 Stunden inkubiert, gefolgt von einer Untersuchung der optischen Dichte bei 450 nm unter Verwendung einer Mikroplatte Detektor (Bio-Rad, USA).

Für den EdU-Assay wurden die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, mit 0,5 % Triton X-100 permeabilisiert und 3 Stunden lang mit EdU (50 µM) gefärbt. Die Kerne wurden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI; Sigma, USA) angefärbt. Die EdU-positive Färbung wurde mit einem Fluoreszenzmikroskop (Carl Zeiss, Deutschland) beobachtet und abgebildet.

Apoptose und Zellzyklus wurden mittels Durchflusszytometrie gemessen. Zur Apoptose wurden Zellen gesammelt und in einem Bindungspuffer suspendiert und mit 5 μl Annexin V-FITC (Sigma, USA) und 5 μl Propidiumiodid (PI; Sigma, USA) für 20 Minuten im Dunkeln markiert. Anschließend wurden die Proben mit einem Durchflusszytometer (BD Biosciences, USA) untersucht.

Zur Zellzykluserkennung wurden die Zellen 3 Tage lang mit 70 % Ethanol bei 4 °C fixiert, in PBS mit 100 μg/ml PI, 1 % Triton-X100 und 100 μg/ml RNase A suspendiert, 30 Minuten lang gefärbt und nachgewiesen unter Verwendung eines Durchflusszytometers (BD Biosciences, USA).

Die intrazelluläre ROS-Akkumulation wurde mittels 2′,7′-Dichlordihydrofluoresceindiacetat (DCFDA)-Färbung gemessen. Kurz gesagt, KGN-Zellen wurden 25 Minuten lang bei 37 ° C mit 10 μM DCFDA in PBS inkubiert und die Kerne 10 Minuten lang mit DAPI angefärbt. Die Zellen wurden gesammelt und mit einem Durchflusszytometer (BD Biosciences, USA) analysiert.

Zur Bestimmung des oxidativen Stresses wurden die MDA-, GSH-, SOD- und CAT-Werte mithilfe kommerzieller Kits (Beyotime, China) gemäß den Protokollen des Herstellers analysiert.

Eierstockgewebe und KGN-Zellen wurden unter Verwendung von TRIzol-Reagenz (Sigma, USA) homogenisiert. Insgesamt 1 µg RNA wurde unter Verwendung von cDNA-Reverse-Transkriptionskits mit hoher Kapazität (Thermo, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers revers in cDNA transkribiert. Die KISS-1-Genspiegel wurden durch qRT-PCR unter Verwendung von SYBR Green/Mix (Thermo Fisher Scientific, USA) nach der 2−△△Ct-Methode quantifiziert. GAPDH wurde als interne Kontrolle verwendet. Die Primersequenzen sind wie folgt aufgeführt. Rattus norvegicus KISS-1, 3'-CAGTGTGCTCCAACTACCCA -5′ (vorwärts), 3′-GTTGTCCAGAGGCTTGGCTG -5′ (rückwärts); Rattus norvegicus GAPDH, 3'-CTCTCTGCTCCTCCCTGTTC -5' (vorwärts), 3'-CGATACGGCCAAATCCGTTC -5' (rückwärts); Homo sapiens KISS-1, 3′-GCACTTCTAGGACCTGCCTC-5′ (vorwärts), 3′-GATTCTAGCTGCTGGCCTGTG-5′ (rückwärts); Homo sapiens GAPDH, 3′-GAATGGGCAGCCGTTAGGAA -5′ (vorwärts), 3′-GAGGGATCTCGCTCCTGGAA -5′ (rückwärts).

Gewebe und Zellen wurden mit Radioimmunpräzipitationsassay (RIPA)-Lysepuffer (SolarBio, China) lysiert, der einen Proteaseinhibitor-Cocktail (Invitrogen, USA) enthielt. Proteine (60 μg) wurden durch 8–10 % Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und auf Polyvinylidenfluoridmembranen (Millipore, USA) übertragen. Nach dem Blockieren mit 5 % fettfreier Milch wurden die Blots mit Primärantikörpern gegen Kisspeptin, PI3K, p-PI3K, Akt, p-AktSer473, ERK1/2, p-ERK1/2, Bax, Bcl-2 und gespaltene Caspase inkubiert -3 und GAPDH (1:1000; Abcam, USA). Anschließend wurden die Proteinbanden mit HRP-konjugiertem sekundären Anti-Kaninchen-Antikörper oder Anti-Maus-Antikörper (1:2000; Abcam, USA) inkubiert und nach Inkubation mit verstärktem Chemilumineszenzreagenz (Millipore, USA) sichtbar gemacht.

Alle Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Vergleiche zwischen zwei oder mehreren Vergleichen wurden mithilfe des Student-t-Tests oder einer einseitigen Varianzanalyse mithilfe der SPSS-Software (Version 19.0) durchgeführt. Die Ergebnisse wurden bei P < 0,05 als statistisch signifikant angesehen.

Wir haben ein DHEA-induziertes PCOS-Rattenmodell mit ölbehandelten Ratten als Kontrolle etabliert. DHEA-Ratten erhielten eine fettreiche Diät, um die PCOS-Phänotypen zu verstärken. Wie in Abb. 1A, B gezeigt, waren Körpergewicht und BMI bei DHEA-Ratten signifikant höher als bei Ratten in der Ölgruppe (P < 0,05). Darüber hinaus waren die RNA- und Proteinspiegel von Kisspeptin in den Eierstock-Körnerzellen von PCOS-Ratten im Vergleich zu denen in der Ölgruppe signifikant verringert (P < 0,05, Abb. 1C, D). Die H&E-Färbung zeigte erhebliche Gewebeschäden in der PCOS-Gruppe, was durch die erhöhte Anzahl unreifer Follikel belegt wurde. Die immunhistochemische Analyse zeigte eine bemerkenswerte Herunterregulierung von Kisspeptin in der PCOS-Gruppe im Vergleich zu der in der Ölgruppe (Abb. 1E). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine verminderte Kisspeptin-Expression mit einer Schädigung der Eierstöcke bei PCOS-Ratten korreliert.

Kisspeptin ist in Ovarialgranulosazellen von PCOS-Ratten herunterreguliert. Das PCOS-Rattenmodell wurde unter Verwendung von DHEA und einer fettreichen Diät erstellt. Als Kontrolle wurden mit Öl gefütterte Ratten eingesetzt. A Das Körpergewicht und B BMI von Ratten. C Der qRT-PCR-Assay zur Messung des KISS-RNA-Spiegels in Eierstöcken. D Der Western Blot zur Überprüfung des Kisspeptin-Proteinspiegels in den Eierstöcken. E Histologische Beurteilung von Gewebeschäden (H&E-Färbung) und Kisspeptinspiegel. *P < 0,05, ***P < 0,001 im Vergleich zur Ölgruppe

Die KGN-Zelllinie ist eine humane Granulosa-ähnliche Tumorzelllinie, deren physiologische Eigenschaften denen normaler Ovarial-Granulosazellen am ähnlichsten sind und die häufig in PCOS-Studien verwendet wird [18]. Um die detaillierte Funktion von Kisspeptin bei der PCOS-Progression zu bestimmen, untersuchten wir die exogene Kisspeptin-Expression in der Ovarial-Granulosa-Zelllinie, KGN. Die Transfektion mit KISS-1-überexprimierenden Vektoren erhöhte die RNA- und Proteinspiegel von Kisspeptin in KGN-Zellen signifikant (P < 0,05, Abb. 2A, B). Die Ergebnisse der CCK-8- und EdU-Färbung zeigten, dass die Überexpression von Kisspeptin im Vergleich zu den Kontrollzellen die Lebensfähigkeit und Proliferation von KGN-Zellen signifikant steigerte (P < 0,05, Abb. 2C, D). Darüber hinaus erhöhte die Überexpression von Kisspeptin den Anteil der Zellen in der S-Phase signifikant, was auf eine verstärkte Zellproliferation hinweist (P < 0,05, Abb. 2E). Darüber hinaus transfizierten wir KGN-Zellen mit Kisspeptin-spezifischen shRNAs, um die RNA- und Proteinspiegel von Kisspeptin effektiv herunterzuregulieren (P <0,05, Abb. 2F, G). Im Gegensatz zur durcheinandergemischten Kontrollgruppe unterdrückten Kisspeptin-shRNAs die Lebensfähigkeit, Proliferation und den Anteil von S-Phase-KGN-Zellen signifikant (P < 0,05, Abb. 2H–J).

Kisspeptin fördert die Proliferation der Ovarialgranulosazelllinie KGN. A–E-KGN-Zellen wurden mit KISS-1-überexprimierenden Vektoren oder dem leeren Vektor transfiziert. Die RNA- (A) und Proteinspiegel (B) von Kisspeptin wurden gemessen. Die Zellproliferation und das Fortschreiten des Zellzyklus wurden mithilfe von CCK-8 (C), EdU (D) und Durchflusszytometrie (E) bewertet. F-J-KGN-Zellen wurden mit KISS-1-shRNAs oder der durcheinandergemischten shRNA transfiziert. Die RNA- (F) und Proteinspiegel (G) von Kisspeptin wurden gemessen. Die Zellproliferation und das Fortschreiten des Zellzyklus wurden mit CCK-8 (H), EdU (I) und Durchflusszytometrie (J) bewertet. ns, nicht signifikant; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001

Wir untersuchten die Apoptose von KGN-Zellen nach der Transfektion mit dem Kisspeptin-Überexpressionsplasmid und shRNAs. Wie in Abb. 3A, B gezeigt, führte die Überexpression von Kisspeptin zu einer verminderten Zellapoptose, einer Hochregulierung des antiapoptotischen Faktors Bcl-2 und einer Herunterregulierung der proapoptotischen Faktoren Caspase-3 und Bax (P < 0,05). Im Gegensatz dazu förderte der Kisspeptin-Knockdown die Apoptose, erhöhte die Expression von gespaltenem Caspase-3 und Bax und unterdrückte die Bcl-2-Expression (P < 0,05, Abb. 3C, D).

Kisspeptin hemmt die Apoptose der Ovarialgranulosazelllinie KGN. A- und B-KGN-Zellen wurden mit KISS-1-überexprimierenden Vektoren oder dem leeren Vektor transfiziert. Zellapoptose (A) und Proteinspiegel von Bcl-2, Bax und gespaltener Caspase 3 (C-Caspase-3) (B) wurden durch Durchflusszytometrie und Western Blot nachgewiesen. C-, D-KGN-Zellen wurden mit KISS-1-shRNAs oder der durcheinandergemischten shRNA transfiziert. Zellapoptose (C) und Proteinspiegel von Bcl-2, Bax und gespaltener Caspase 3 (C-Caspase-3) D wurden durch Durchflusszytometrie und Western Blot nachgewiesen. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001

Wir haben die Auswirkungen von Kisspeptin auf den intrazellulären oxidativen Stress in der Ovarialgranulosazelllinie KGN bestimmt. Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie zeigten, dass Kisspeptin die ROS-Akkumulation hemmte (P <0,05, Abb. 4A). Die MDA-Produktion wurde durch Kisspeptin-Überexpression unterdrückt (P < 0,05, Abb. 4B), wohingegen die Spiegel der antioxidativen Enzyme GSH, SOD und CAT erhöht waren (P < 0,05, Abb. 4C – E), was auf antioxidative Wirkungen schließen lässt von Kisspeptin. Im Gegensatz dazu stimulierte der Abbau von Kisspeptin die Akkumulation von intrazellulären ROS und MDA (P < 0,05, Abb. 4F, G) und verringerte die Konzentration antioxidativer Enzyme (P < 0,05, Abb. 4H – J).

Kisspeptin hemmt den oxidativen Stress der Ovarialgranulosazelllinie KGN. A–E-KGN-Zellen wurden mit KISS-1-überexprimierenden Vektoren oder dem leeren Vektor transfiziert. Die intrazellulären Spiegel von ROS (A), MDA (B) und den antioxidativen Enzymen GSH (C), SOD (D) und CAT (E) wurden gemessen. F-J-KGN-Zellen wurden mit KISS-1-shRNAs oder der durcheinandergemischten shRNA transfiziert. Die intrazellulären Spiegel von ROS (F), MDA (G) und den antioxidativen Enzymen GSH (H), SOD (I) und CAT (J) wurden gemessen. *P < 0,05, **P < 0,01

Studien haben über die regulatorische Wirkung von Kisspeptin auf die PI3K/AKT- und ERK-Signalwege berichtet [19, 20]. Hier haben wir weiter analysiert, ob diese Regulation in KGN-Zellen existiert. Wir beobachteten, dass die Spiegel an phosphoryliertem PI3K, AKT und ERK in KGN-Zellen in Kisspeptin-überexprimierenden Zellen erhöht waren, wohingegen die Spiegel an Gesamt-PI3K, AKT und ERK unverändert blieben (P <0, 05, Abb. 5A), was auf die Aktivierung hinweist der PI3K/AKT- und ERK-Signalisierung. Im Gegensatz dazu unterdrückte der Abbau von Kisspeptin mithilfe von shRNAs die Spiegel von p-PI3K, p-AKT und p-ERK (P < 0,05, Abb. 5B), was auf eine Inaktivierung der PI3K/AKT- und ERK-Signalwege hindeutet.

Kisspeptin induziert die Aktivierung des PI3K/AKT/ERK-Signalwegs. KGN-Zellen wurden mit KISS-1-überexprimierenden Vektoren (A), shRNAs, die auf KISS-1 abzielen (B), oder den Negativkontrollen transfiziert. Die phosphorylierten und Gesamtspiegel von PI3K, AKT und ERK wurden durch Western Blot gemessen. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001

Wir haben das Kisspeptin/PI3K-Achsen-vermittelte Verhalten von Ovarialgranulosazellen mithilfe des ERK1/2-Antagonisten PD98059 bestätigt. Wie in Abb. 6A, B gezeigt, verringerte die Behandlung mit PD98059 die durch Kisspeptin verstärkte Zellproliferation und beseitigte die antiapoptotischen Wirkungen von Kisspeptin (P < 0,05). Darüber hinaus wurde die durch Kisspeptin-Überexpression induzierte Abnahme der ROS-Spiegel durch die Behandlung der Zellen mit PD98059 umgekehrt (P <0, 05, Abb. 6C). Diese Daten zeigen, dass Kisspeptin die Proliferation, Apoptose und oxidativen Stress der Ovarialgranulosazellen über die ERK1/2-Signalkaskade moduliert.

Kisspeptin fördert das Überleben von KGN-Zellen durch Aktivierung des PI3K/AKT/ERK-Signals. KGN-Zellen wurden mit dem KISS-1-Überexpressionsvektor transfiziert und mit einem ERK1/2-Antagonisten PD98059 behandelt. Die Zelllebensfähigkeit (A), Apoptose (B) und ROS-Erzeugung (C) wurden untersucht. **P < 0,01, ***P < 0,001

Obwohl PCOS eine häufige gynäkologische Erkrankung bei Frauen ist [21], sind die Mechanismen, die an der Ätiologie und Pathologie von PCOS beteiligt sind, noch unklar. Eine veränderte Genexpression könnte eine wesentliche Rolle bei der Entstehung und dem Fortschreiten von PCOS spielen [22]. Das DHEA-stimulierte Rattenmodell weist Eierstock-, endokrine und metabolische Merkmale auf, die denen des menschlichen PCOS ähneln, wie z. B. polyzystische Eierstöcke, übermäßige Androgene und Glukoseintoleranz [23]; Daher wird es häufig in PCOS-Studien verwendet [24,25,26]. Hier untersuchten wir die Expression von Kisspeptin im PCOS-Rattenmodell und beobachteten im Vergleich zu Ratten aus der Kontrollgruppe signifikant verringerte Kisspeptin-RNA- und Proteinspiegel in Ovarialgranulatzellen von DHEA-stimulierten PCOS-Ratten. Darüber hinaus wurden in vitro die vorteilhaften Wirkungen von Kisspeptin auf die Förderung der KGN-Zellproliferation, das Fortschreiten des Zellzyklus und die Hemmung von Zellapoptose und oxidativem Stress beobachtet. Diese Ergebnisse deuten auf eine mögliche schützende Rolle von Kisspeptin bei PCOS hin, was mit seiner wichtigen Rolle bei der Kontrolle des männlichen Hormonspiegels und der Aufrechterhaltung der normalen Funktion des Fortpflanzungssystems übereinstimmt [27].

Kisspeptin ist ein wesentlicher Regulator der Fortpflanzungsfunktion und seine Expression steht in engem Zusammenhang mit der vorzeitigen Pubertät [28]. Die Kisspeptin-Expression gilt auch als Marker für die PCOS-Diagnose. Eine Metaanalyse mit 660 PCOS-Patienten und 600 Kontrollpersonen zeigte eine höhere Blutkonzentration von Kisspeptin bei Patienten mit PCOS als bei Kontrollpersonen, und die Kisspeptinspiegel unterschieden sich zwischen nicht übergewichtigen und adipösen Patienten [29]. Allerdings war die Kisspeptin-Expression in den Wandgranulosa- und Cumuluszellen von Frauen mit PCOS geringer als bei gesunden Kontrollpersonen [30]. In ähnlicher Weise war die hypothalamische Kisspeptin-Expression in einem Dihydrotestosteron-induzierten Rattenmodell für PCOS verringert [31]. Eine hypothalamische Herunterregulierung der Kisspeptin-Expression wurde auch in Testosteron- und Östradiol-induzierten Rattenmodellen bestätigt [32]. In dieser Studie beobachteten wir eine geringere Kisspeptin-Expression in den Eierstock-Körnerzellen von DHEA-stimulierten PCOS-Ratten. Daher können verschiedene Körperbereiche oder Tiermodelle von PCOS mit unterschiedlichen metabolischen Phänotypen zu einer unterschiedlichen Kisspeptin-Expression führen.

Frühere Studien haben gezeigt, dass die Apoptose und Dysfunktion von Ovarialgranulosazellen eng mit PCOS korreliert [33, 34]. Die Verbesserung des Überlebens von Ovarialgranulosazellen ist für die PCOS-Behandlung wichtig. Eine geringere Kisspeptin-Expression in menschlichen Granulosazellen, die von Patienten mit PCOS isoliert wurden, trägt zu einer abnormalen Entwicklung und Ovulation des Eierstocks während PCOS bei [30]. Die Zugabe von Kisspeptin zu Eierstockzellen von Schweinen führt zur Zellproliferation und zur Hemmung der Apoptose [35]. Wir beobachteten, dass die Überexpression von Kisspeptin die Proliferation förderte und gleichzeitig Apoptose und oxidativen Stress in der Ovarial-Granulosa-Zelllinie KGN hemmte, wohingegen die Unterdrückung von Kisspeptin zu entgegengesetzten Ergebnissen führte. Daher spekulierten wir, dass Kisspeptin das Fortschreiten von PCOS hemmt, indem es die Apoptose in Ovarialgranulosazellen lindert.

Oxidativer Stress führt zu einer abnormalen Ansammlung von ROS, die häufig durch ein Ungleichgewicht zwischen Prooxidantien und Antioxidantien verursacht wird [6]. Übermäßiger oxidativer Stress in Granulosazellen der Eierstöcke führt zur Apoptose [36, 37]. Mehrere Studien haben über die Akkumulation oxidativer zirkulierender Marker bei Patienten mit PCOS berichtet und wurden als potenzielle Auslöser der PCOS-Pathogenese angesehen [3, 6]. Wir haben gezeigt, dass die Überexpression von Kisspeptin die Akkumulation von ROS und MDA (dem Produkt der Lipidperoxidation) verringert und die Spiegel der Antioxidantien GSH, SOD und CAT in KGN-Zellen erhöht, was darauf hindeutet, dass Kisspeptin die Granulosazellen der Eierstöcke vor oxidativem Stress schützt. Weitere Studien sind erforderlich, um die Auswirkungen von Kisspeptin auf andere Aspekte der Körnerzellen der Eierstöcke, einschließlich Entzündungen, zu untersuchen, da die Freisetzung von Zytokinen aus Körnerzellen der Eierstöcke eine wesentliche Rolle bei der Pathogenese von PCOS spielt [38, 39].

Eine weitere Untersuchung der molekularen Mechanismen legte nahe, dass Kisspeptin die PI3K/AKT- und ERK-Signalwege aktivierte und die Hemmung von ERK durch einen Antagonisten die proliferativen und antioxidativen Funktionen von Kisspeptin unterdrückte. Studien haben gezeigt, dass die PI3K/AKT-Signalübertragung nachgeschaltete pro- und anti-apoptotische Gene moduliert, darunter Bax, Caspase-3 und Bcl-2, die eine entscheidende Rolle bei der Modulation der Proliferation und Apoptose von Ovarialgranulosazellen spielen [40,41,42]. ,43]. Allerdings konnten wir erstmals einen Zusammenhang zwischen Kisspeptin und dem PI3K/AKT/ERK-Signalweg in Ovarialgranulosazellen nachweisen.

Inositol ist ein wichtiger Bestandteil von Strukturlipiden, nämlich Phosphatidylinositol (PI) und seinen Phosphaten, einschließlich Phosphatidylinositolphosphat (PIP)-Lipiden. Die Aktivierung von PI3K hängt von der Bindung der p110- und p85-Untereinheiten ab, die PIP2 in PIP3 umwandeln. Es ist bekannt, dass Inositole verschiedene entscheidende Aktivitäten bei verschiedenen Erkrankungen des Menschen ausüben, indem sie verschiedene Signalwege, einschließlich PI3K/AKT, modulieren [44]. Inositole reduzieren die PI3K-Spiegel und wirken so der Aktivierung des PKC/RAS/ERK-Signalwegs nach der PI3K-Aktivierung entgegen [45]. Bei mit Insulinresistenz verbundenen menschlichen Erkrankungen wie PCOS hängt die fehlerhafte AKT-Phosphorylierung stark von der deregulierten Verfügbarkeit von Inositen ab [46]. Derzeit gilt Myo-Inositol als wirksam bei der Behandlung von Unfruchtbarkeit und Menstruationsstörungen bei Patienten mit PCOS [44, 47]. Die Korrelation zwischen Inositol, PI3K/AKT und Kisspeptin bei PCOS sollte hervorgehoben werden, um das biochemische Netzwerk, das dem PCOS-Metabolismus gemeinsam ist, besser zu verstehen.

Unsere Studie zeigte, dass die Kisspeptin-Expression in den Ovarialgranulosazellen von PCOS-Ratten signifikant verringert war. Die Überexpression von Kisspeptin verbesserte die Proliferation, linderte die Apoptose von Ovarialgranulosazellen und verringerte die ROS-Erzeugung und den oxidativen Stress durch Aktivierung des PI3K/AKT- und ERK-Signalwegs.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind nicht öffentlich verfügbar, da der Artikel nicht veröffentlicht wurde, sind aber auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Katalase

Zellzählset-8

Dehydroepiandrosteron

5-Ethinyl-2′-desoxyuridin

Hämatoxylin und Eosin

Glutathion

Malondialdehyd

Reaktive Sauerstoffspezies

PCO-Syndrom

Hyperventilieren

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Zentrum für Reproduktionsmedizin, Volkskrankenhaus Weifang, Nr. 151, Guangwen Street, Bezirk Kuiwen, Weifang, 261000, Shandong, China

Pingping Sun, Yuemin Zhang, Lilan Sun, Na Sun, Jinguang Wang und Huagang Ma

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Konzeption und Design: PP S; Experiment: PP S, YM Z, LL S und NS; Datenanalyse und Interpretation: JG W und HG M; Endgültige Genehmigung des Manuskripts: Alle Autoren. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Huagang Ma.

Das Versuchsprotokoll unserer Studie wurde in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und vom Weifang People's Hospital genehmigt. Alle Methoden werden gemäß den ARRIVE-Richtlinien gemeldet.

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 14. Juli 2022

Angenommen: 30. Dezember 2022

Veröffentlicht: 11. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12905-022-02154-6

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