Metaboliten-Fingerprinting von Phytobestandteilen aus Fritillaria cirrhosa D. Don und molekulare Docking-Analyse von bioaktivem Peonidin mit mikrobiellen Wirkstoffzielproteinen

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 7296 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Fritillaria cirrhosa D. Don (Liliaceae), ein wertvolles und vom Aussterben bedrohtes Heilkraut aus Nordwestindien, einschließlich Jammu und Kaschmir, wächst in gemäßigten bis alpinen Regionen des Himalaya. Es ist als traditionelles Kraut gegen Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Atemwegserkrankungen und Stoffwechselstörungen bekannt. Die Pflanzenzwiebeln sind wertvoll und werden zur Heilung vieler anderer gesundheitlicher Komplikationen eingesetzt. Die aktuelle Studie analysierte die Phytobestandteile mittels Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) verschiedener Rohextrakte (Methanol, Petrolether und Ethylacetat) von F. cirrhosa. Die LC-MS-Analyse der Zwiebeln von F. cirrhosa ergab 88 bioaktive Verbindungen, von denen die überwiegende Mehrheit therapeutische Anwendungen hat. Darüber hinaus zeigte die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentrationen (MICs) mittels Bouillon-Mikroverdünnungsmethode von F. cirrhosa gegen getestete bakterielle und pilzliche Krankheitserreger bemerkenswerte Ergebnisse mit MICs zwischen 6,25–200 µg/ml bzw. 50–400 µg/ml. Anschließend wurden diese 88 identifizierten Phytoverbindungen durch ADMET-Vorhersage durch SwissADME und In-silico-Molecular-Docking-Studien auf ihre Bioaktivität getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass Peonidin unter den identifizierten phytochemischen Verbindungen möglicherweise die maximale antibakterielle und antimykotische Aktivität gegen verschiedene mikrobielle Proteinziele für Arzneimittel aufweist. Darüber hinaus wurde der Komplex mit der höchsten Bindungsaffinität einer molekulardynamischen Simulationsanalyse (MDS) mit Desmond Schrodinger v3.8 unterzogen. Die durch die molekulardynamischen Simulationen erhaltenen Diagramme der quadratischen Mittelabweichung (RMSD) zeigten die tatsächlichen Bindungswechselwirkungen an, die mithilfe der Diagramme der quadratischen Mittelfluktuation (RMSF) weiter validiert wurden, was ein besseres Verständnis der in den Proteinen vorhandenen Aminosäuren ermöglichte verantwortlich für die molekularen Bewegungen und Fluktuationen. Nach unserem besten Wissen ist dies die erste Beschreibung der phytochemischen Bestandteile der Zwiebeln von F.cirrhosa, die mittels LC-MS analysiert wurden und eine pharmakologische Bedeutung aufweisen. Die In-silico-Studie zum molekularen Docking und zur Molekulardynamik von Peonidin wurde ebenfalls durchgeführt, um seine Breitbandaktivitäten basierend auf den Bindungswechselwirkungen mit den antibakteriellen und antimykotischen Zielproteinen zu bestätigen. Die vorliegenden Studienergebnisse werden einen Weg für die Erfindung pflanzlicher Arzneimittel gegen verschiedene Krankheiten unter Verwendung von F. cirrhosa-Pflanzen schaffen, was zur Entwicklung neuartiger Arzneimittel führen könnte.

Heilpflanzen spielen eine zentrale Rolle in der primären Gesundheitsversorgung und bieten eine reichhaltige Quelle neuartiger bioaktiver Verbindungen für die Arzneimittelforschung und -entwicklung1,2. Infektionskrankheiten stellen ein Problem der öffentlichen Gesundheit dar und stellen weltweit eine bedeutende Todesursache dar3,4,5. Infektionen durch pathogene Mikroorganismen stellen ein ernstes Problem für die menschliche Gesundheit dar6. Zunehmende Fälle von Arzneimittelresistenzen, unerwünschte Nebenwirkungen bestehender Antibiotika und das Wiederauftreten früher bekannter Infektionen machen den Bedarf an neuen, sicheren und wirksamen antimikrobiellen Wirkstoffen erforderlich3,7,8,9,10. Bei der Arzneimittelentwicklung handelt es sich bei virtuellen Screenings wie der Arzneimittelähnlichkeit und der ADMET-Analyse um rechnerische Methoden, um mithilfe verschiedener In-silico-Simulationsmethoden11 Verbindungen zu finden, die wahrscheinlich in kurzer Zeit und zu geringen Kosten physiologische Aktivität zeigen.

Die Familie der Liliaceae beherbergt einen gelben Himalaya-Scheckenfalter12,13,14, der gelblich bis grün oder bräunlich bis violett blüht. Die glockenförmigen Blüten kommen häufig in den Alpenregionen zwischen 2700 und 4900 m13,14 vor und sind in China und den Regionen des indischen Subkontinents beheimatet. Sie ist weithin als Fritillaria cirrhosa D. Don bekannt. ist ein mehrjähriges und vom Aussterben bedrohtes Heilkraut der Astavarga-Gruppe [eine Gruppe von acht Heilkräutern, die im traditionellen medizinischen Wissen (TMK) und im traditionellen medizinischen System (TMS) in Indien verwendet werden]. Wächst an offenen, sonnigen Hängen gemäßigter bis alpiner Regionen des Himalaya15. Sie kommt im westlichen gemäßigten Himalaya von Kaschmir bis Kumaon in einer Höhe von 2700 bis 4035 m über dem Meeresspiegel vor16 und von Pakistan bis Uttarakhand in einer Höhe von 2700 bis 4000 m über dem Meeresspiegel17. Laut der während der Studie durchgeführten Felduntersuchung wurde die Art in den Regionen Gulmarg, Kongdori, Khillenmarg und Botapathri in Kaschmir gefunden. Den Aufzeichnungen des KASH (Kashmir University Herbarium) zufolge wurde die Art in den Regionen Gulmarg, Apharvat, Thajwas, Zojila, Langait und Gurez in Kaschmir gefunden. Die Zwiebeln dieser Pflanze sind reich an bioaktiven Verbindungen wie Sipeimin, das zur Behandlung vieler Atemwegserkrankungen eingesetzt wird. Mehr als hundert wichtige bioaktive Phytoverbindungen und andere bedeutende chemische Verbindungen wurden bis heute aus F. cirrhosa identifiziert, isoliert und extrahiert18. Zu diesen Bestandteilen gehören Alkaloide wie Peiminin, Peimin, Peimisin, Imperialin usw.19,20,21. Chinesische Mediziner haben diese Pflanze eingesetzt, um ihre medizinische und therapeutische Wirksamkeit zu verdeutlichen22. Es ist ein bitteres Stärkungsmittel und Magen-Darm-Stimulans, das Fieber und Harnwegsinfektionen lindert und ein Arzneimittel gegen 80 Krankheiten ist23. Es wird unter anderem als Kältemittel, Diuretikum, Galaktagogen, schleimlösend und Aphrodisiakum verwendet. Es wird zur Behandlung von Rheuma, Tuberkulose und Hämatemesis eingesetzt. Es lindert auch die Beschwerden schwangerer Frauen, fördert das Fleischwachstum und lindert verschiedene Schmerzen und Symptome24. Die in den Zwiebeln von F. cirrhosa gefundenen Alkaloide haben nachweislich blutdrucksenkende21,25, entzündungshemmende21,26, antitumorale21,25,27, hustenstillende, schleimlösende21,26,28 und antiasthmatische Wirkung21,28.

Diese Ergebnisse stützen die Hypothese, dass F. cirrhosa eine wertvolle Heilpflanze ist. Obwohl die Extrakte von F. cirrhosa traditionell verwendet und daher ausführlich für verschiedene pharmakologische Aktivitäten untersucht und berichtet wurden. Da die chemischen und antimikrobiellen Studien des in Jammu und Kashmir wachsenden F. cirrhosa noch nicht ausgereift zu sein scheinen, haben wir die vorliegenden Studien durchgeführt, um die verschiedenen Extrakte zu charakterisieren und ihre antimikrobielle Aktivität durch molekulare Docking-Studien, ADMET-Analyse und In-vitro zu untersuchen Ansätze zum ersten Mal. Hier berichten wir über die antimikrobielle Aktivität von drei verschiedenen Extrakten gegen verschiedene Bakterien- und Pilzstämme.

F. cirrhosa-Zwiebeln wurden im Jahr 2020 an vier Standorten (nämlich Razdhan-Gipfel, Sadhna-Pass, Tangdhar Main, Apharvat Gulmarg) in Jammu und Kashmir gesammelt. Die geografischen Koordinaten der Standortprobe sind in (Tabelle 1) aufgeführt. Die Pflanze wurde von Akhtar Malik, Kurator und Taxonom an der Abteilung für Botanik der Universität Kaschmir, identifiziert.

Aufgrund ihres Polaritätsindex wurden Petrolether, Ethylacetat und Methanol als Extraktionslösungsmittel ausgewählt. Fein gemahlenes pulverisiertes Pflanzenmaterial (5 g) wurde in den oben genannten Lösungsmitteln extrahiert. Um die natürliche antimikrobielle Aktivität in einem Probenextrakt aufrechtzuerhalten und eine maximale Extraktion zu ermöglichen, wurde die Mischung 48 Stunden lang auf einem Inkubator-Rotationsschüttler bei (200 U/min) und 25 °C gelagert. Nach dem Filtrieren der Extrakte durch Whatman-Filterpapier (Nr. 1) wurde das Filtrat 15 Minuten lang bei 8000 U/min und 12 °C zentrifugiert, um einen klaren Überstand zu erhalten. Die in verschiedenen Lösungsmitteln hergestellten Extrakte wurden unter reduziertem Druck in einem Rotationsverdampfer eingedampft und verdünnt, um eine Stammlösung mit einer Konzentration von 10 mg/ml zu erhalten, die in mit Aluminiumfolie beschichteten Falcon-Röhrchen bei 4 °C im Kühlschrank für später aufbewahrt wurde Verwendung29.

Für die LC-MS-Analyse wurde Nexera UHPLC mit einer quaternären Pumpe, einer zentralen Entgasungseinheit, einem Autosampler und einer DAD-Einheit verwendet. Die Elution erfolgte mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min mit Petrolether, Ethylacetat und Methanol als Lösungsmittel. Nach der Ultraschallbehandlung wurden alle Lösungsmittel durch 0,45 µm Nylonpapier geleitet. Bei 270 nm wurden die Chromatogramme untersucht und die Ergebnisse mithilfe einer im Labor entwickelten Software ermittelt30. Die Pflanzenextrakte wurden unter Verwendung von Petrolether, Ethylacetat, Methanol und Bioanalyse formuliert, um wichtige Metaboliten und Phytoverbindungen zu identifizieren. Das Vorhandensein von 88 Phytoverbindungen wurde durch die Durchführung einer LC-MS-Analyse dieser Extrakte festgestellt.

Die Mikroben wurden von der Gene Bank von IMTECH in Chandigarh und der American Gene Bank bezogen. Auf antibakterielle und antimykotische Aktivität wurden sechs Bakterienstämme und drei Pilzstämme untersucht (Escherichia coli MTCC443, Klebsiella pneumonia MTCC19, Microbacterium luteus, Streptococcus pneumonia MTCC 655, Haemophilus influenzae MTCC 3826, Neisseria mucosa MTCC 1722 und Candida albicans ATCC 24433, Candida glabrata ATCC2001 , Candida parapsilosis ATCC90018).

Alle Kulturen wurden für ein besseres Wachstum im Inkubator bei 37 °C gehalten. Für jedes Experiment wurden die vorbereiteten Aliquots aufgetaut und in Brühe mit 10 % ADC (Albumin-Dextrose-Katalase Himedia, Indien), 0,2 % Glycerin (Merck, Indien) und 0,05 % Tween 80 (Merck, Indien) subkultiviert Die Kulturen wurden bis zur stationären Phase gezüchtet und für andere Experimente weiterverarbeitet.

Die minimale Hemmkonzentration in der vorliegenden Studie wurde durch die Brühenverdünnungsmethode von Muller Hinton erreicht. In der vorliegenden Studie wurden der Brühe 10 % ADC zugesetzt, gefolgt von der Durchführung einer zweifachen seriellen Konzentration von 0,00 bis 0,20 µg/ml Antibiotika, einschließlich Ciprofloxacin und Amphoterecin-B in verschiedenen Kombinationen, mit Pilz- und Bakterienkulturen. Darüber hinaus wurde jede beimpfte Platte 24 bis 48 Stunden lang in einem Inkubator bei 37 °C aufbewahrt. Um das Zellwachstum zu überwachen und die Wachstumshemmung zu beobachten, wurde die minimale Hemmkonzentration des Arzneimittels notiert. Als MHK wurde die niedrigste Konzentration eines antimikrobiellen Mittels angesehen, bei der kein ausgeglichenes Wachstum beobachtet wurde. Darüber hinaus wurden koloniebildende Einheiten zur besseren Nutzung am 28. Tag der Inkubation bei 37 °C gemessen.

Im Hinblick auf Arzneimittelwechselwirkungen wurden die mikrobiellen Kulturen in verschiedenen Konzentrationen von Ciprofloxacin und Amphotericin B in mehreren Kombinationen gezüchtet. Die antimikrobiellen Mittel wurden zugegeben, um eine 8-fache MHK für beide antimikrobiellen Mittel zu erzeugen, gefolgt von zweifachen Verdünnungen, die zu 1/64-fachen MHK-Konzentrationsbereichen jedes Arzneimittels sowohl allein als auch in Kombination führten, was zugesichert wurde31.

Die molekulare Docking-Analyse wurde für alle ausgewählten Phytoverbindungen aus den LC-MS-Datenfraktionen durchgeführt. Chemische Strukturen von Phytoverbindungen, die aus der PubChem-Datenbank im SDF-Format abgerufen und mit PyMol Version 3.0 in das Proteindatenbankformat (PDB) konvertiert wurden. Software. Die ausgewählten Ziele für diese Studie basierten auf früheren Studien und alle 3D-Kristallstrukturen wurden von (PDB) im PDB-Format abgerufen. Die Strukturinformationen des aus Fritillaria cirrhosa identifizierten Peonidins wurden ebenfalls aus der PubChem-Datenbank im SDF-Format abgerufen und mithilfe eines offenen Babel-Servers in das PDB-Format konvertiert. Peonidin ist eine der durch LC-MS-Analyse identifizierten Verbindungen. Es zeigt apoptotische Wirkungen in den Brustkrebszellen32.

Peonidin ist ein Anthocyanid, das leicht aus dem menschlichen Körper ausgeschieden werden kann. Anthocyane (ACNs), einschließlich Peonidin, sind natürliche bioaktive Verbindungen mit vielen pharmakologischen Wirkungen: antioxidativ, entzündungshemmend, Vorbeugung altersbedingter chronischer Krankheiten: Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD), Krebs, neurodegenerative und Augenerkrankungen. ACNs haben auch antivirale Eigenschaften. Aktuelle In-vitro-Studien haben gezeigt, dass sie die Replikation von Viren wie Herpes simplex, Parainfluenzavirus, Syncytialvirus, HIV, Rotavirus und Adenovirus hemmen können33. Das breite Spektrum an pharmakologischen Eigenschaften, die durch präklinische und klinische Beweise in Verbindung mit einer geringen Toxizität gestützt werden, macht ihren pharmakotherapeutischen Einsatz sehr attraktiv. Peonidin wurde in der aktuellen Studie aufgrund seiner pharmakologischen Eigenschaften als geeigneter Ligand ausgewählt. Verbindungen mit antimikrobieller Aktivität deaktivieren Bakterien, indem sie auf wichtige Komponenten des bakteriellen Stoffwechsels abzielen, darunter Dihydropterotsynthase (DHPS), Penicillin-bindendes Protein (PBP), Elongationsfaktor Tu, 1,3-Beta-Glykan, ABC-Transporter und Beta-Tubulin. Diese sechs Schlüsselproteine spielen eine entscheidende Rolle im Lebenszyklus von Pilzen und Bakterien. Penicillin-bindende Proteine (PBPs) sind membranassoziierte Proteine, die eine wichtige Rolle bei der Bildung der Zellwand spielen34,35. Wie bereits erwähnt, zielen Antibiotika auf das Dihydropteroat-Synthase-Enzym ab36. Dieses Enzym ist am Folatsyntheseweg beteiligt, der direkt mit der Nukleinsäuresynthese verbunden ist37. Die Hemmung dieses Enzyms mit einem starken Antibiotikum hat eine tiefgreifendere und irreversiblere Wirkung auf die Proteinproduktion des Bakteriums. Die Hauptaufgabe von EF-Tu besteht darin, aminoacylierte tRNAs zum Ribosom zu transportieren. Seit den 1970er Jahren zielen Antibiotika gezielt auf EF-Tu als Therapeutikum ab38. ABC-Transporter (ATP-Bindungskassette) kommen in allen drei Lebensbereichen vor und vermitteln den Transmembrantransport einer Vielzahl von Substraten, darunter Medikamente, Proteine, Kohlenhydrate, Aminosäuren, Ionen und Kohlenhydrate. Es ist seit langem bekannt, dass Glucane eine immunmodulatorische Wirkung haben39. Tubulin sind die Proteinuntereinheiten von Mikrotubuli, die bei der Zellteilung prokaryotischer und eukaryotischer Organismen helfen40. Vor diesem Hintergrund wurde die molekulare Docking-Studie durchgeführt, um die Bindungswechselwirkungen von Peonidin mit diesen mikrobiellen Wirkstoffzielen zu untersuchen. Alle Zielrezeptoren wurden im PDB-Format aus der Proteindatenbank (PDB) abgerufen und einer Reinigung und Verfeinerung unterzogen. Alle Rezeptoren wurden für die molekulare Docking-Analyse mit Biovia Discovery Studio vorbereitet und entfernen unerwünschte Liganden, Wassermoleküle und andere Verunreinigungen aus allen an der Studie beteiligten Proteinen.

Das Biovia Discovery Studio wurde verwendet, um unerwünschte Liganden, Wassermoleküle und andere Verunreinigungen aus allen an der Studie beteiligten Proteinen zu entfernen. Während des Herstellungsprozesses wurden dem Protein polare Wasserstoffe zugesetzt, um die Wechselwirkungen zu verbessern, gefolgt von Kollman-Ladungen. Die 2D-Struktur und 3D-Struktur von Peonidin wurden mithilfe der PubChem-Datenbank (PubChem CID: 5281708) abgerufen. Die 3D-Strukturen von Dihydropteroat-Synthase (DHPS), Penicillin-bindendem Protein (PBP), Elongationsfaktor Tu, 1,3-Beta-Glykan, ABC-Transporter und Beta-Tubulin wurden aus der Proteindatenbank abgerufen (Abb. 1).

3D-Struktur verschiedener Bakterien- und Pilzproteine.

Die Docking-Berechnung und die Algorithmen zur Reproduktion der Taschenbindungsreste wurden unter Verwendung von Co-Kristallliganden verifiziert. In der aktuellen Studie haben wir den Lamarckschen Genetischen Algorithmus in Autodock Vina 4.2 verwendet, um die Docking-Analyse mit den Standardparametern zu starten. Darüber hinaus wurden alle Transformationen unter Berücksichtigung des RMSD von 4,0 A geclustert und die günstigsten Bindungspositionen wurden in Abhängigkeit von der niedrigsten freien Energie und Inhibitionskonstante ausgewählt. Die molekularen Docking-Studien wurden an allen ausgewählten Phytoverbindungen aus den LC-MS-Datenabschnitten durchgeführt. Chemische Strukturen von Phytoverbindungen wurden im SDF-Format aus der PubChem-Datenbank abgerufen und mit PyMol Version 3.0 in das PDB-Format übersetzt. Die Ziele für diese Untersuchung wurden auf der Grundlage der Erkenntnisse früherer Forschungen ausgewählt und alle 3D-Kristallstrukturen wurden im .pdb-Format aus der Proteindatenbank gesammelt. Basierend auf den Isolationsmodi und artspezifischen Varianten wurden die Kristallstrukturen von Proteinen wie Dihydropterotensynthase, Penicillin-bindendem Protein und Elongationsfaktor Tu (Ef-Tu), 1,3-Beta-Glycan, ABC-Transporter und Beta-Tubulin ermittelt .

Die Arzneimittelähnlichkeit von Verbindungen wurde auf der Grundlage eines bereits etablierten Konzepts von Lipinski et al.41 vorhergesagt. Die Strukturen aller pharmakologisch wichtigen Verbindungen wurden in ihr kanonisches vereinfachtes Molekular-Input-Line-Entry-System (SMILE) umgewandelt. Sie reichten das Tool SwissADME und PreADMET ein, um die Pharmakokinetik in silico abzuschätzen, beispielsweise die Anzahl der Wasserstoffdonatoren, Wasserstoffakzeptoren, drehbaren Bindungen und die gesamte polare Oberfläche einer Verbindung. Die Organtoxizitäten und toxikologischen Endpunkte dieser Verbindung wurden mithilfe von PreADMET und OSIRIS Property42 vorhergesagt. Die Auswahl der Verbindungen als Medikamentenkandidaten wurde durch einen Drug-Score-Parameter bestimmt. Je höher der Drug-Score-Wert, desto höher ist die Chance, dass der Wirkstoff als Medikamentenkandidat gilt43.

Das Desmond-Schrödinger-Paket wurde für die molekulardynamische Simulation mit dem angedockten Komplex mit der höchsten Bindungsaffinität verwendet, um die angedockte Berechnung und Interpretation zu analysieren. Die Analyse umfasste einen Simulationslauf über 100 ns, um die Stabilität von Strukturen zu überprüfen. Desmonds eingebaute Parameter wurden auch für die Proteinvorbereitung und Bindungsordnungen verwendet. Bei Bindungsordnungen werden auch die Zugabe von Wasserstoffbindungen und das Auffüllen fehlender Reste im Anfangsprozess optimiert. Das OPLS-Kraftfeld wurde verwendet, um das Builder-System für die Standardsimulationsgitterbox zu initiieren. Und die Konformation wurde in Form von Simulationstrajektorien abgerufen, die mithilfe von Diagrammen der quadratischen Mittelwertabweichung und der quadratischen Mittelwertschwankung durch Wasserstoffbrückenbindungsanalyse und Diagramme des Gyrationsradius analysiert werden konnten.

Die phytochemische Untersuchung verschiedener Extrakte aus den Zwiebeln von F. cirrhosa ergab eine Vielzahl sekundärer Pflanzenstoffe. Die wesentlichen Bestandteile in Petrolether, Ethylacetat und methanolischen Extrakten sind in Tabelle 2 dargestellt.

Die Trennung einzelner in einem Lösungsmittel vorliegender Komponenten anhand ihres Masse-/Ladungsverhältnisses ist das Arbeitsprinzip der Flüssigkeitschromatographie-Massenspektroskopie (LC-MS). Die chemische Zusammensetzung der Extrakte aus F. cirrhosa, analysiert durch LC-MS, ist in (Tabelle 3; Abb. 2) dargestellt. Die LC-MS-Gesamtionenchromatogramme verschiedener Extrakte von F. cirrhosa sind in (Abb. 3, 4, 5) dargestellt. Die durch Soxhlet-Extraktion durchgeführte Lösungsmittelextraktion wurde einer LC-MS-Analyse unterzogen, um 88 wichtige bioaktive Phytoverbindungen zu erhalten (ergänzende Datendatei). Unter Verwendung des methanolischen Extrakts usw. wurden insgesamt 22 Phytoverbindungen erhalten. d-Glucose-6-phosphat-Dinatriumsalz, 3-Hydroxy-dl-kynurenin, Leucylleucyltyrosin und Ononin sind einige Verbindungen, die durch den methanolischen Extrakt gewonnen werden. Linarin, 1,6-Anhydro-beta-d-glucose und O-Phosphorylethanolamin waren bedeutende Anteile unter den 28 Phytoverbindungen, die durch den Petroletherextrakt gewonnen wurden. Peonidin, 2,5,7,8-Tetramethyl-2-(4,8,12-trimethyltridecyl)-6-chromanolacetat, Arachidonsäure und 19 weitere Verbindungen wurden unter Verwendung des Ethylacetatextrakts abgeleitet.

Strukturen der identifizierten Verbindungen basierend auf LC-MS von F. cirrhosa, erstellt mit ChemDraw Pro 16.0 Suite (Perkin Elmer, USA).

LC-MS-ESI-MS-Chromatogramme von Referenzverbindungen mit Nexera in Petrolether.

LC-MS-ESI-MS-Chromatogramme von Referenzverbindungen mit Nexera in Ethylacetat.

LC-MS-ESI-MS-Chromatogramme von Referenzverbindungen unter Verwendung von Nexera in methanolischem Extrakt.

Im Hinblick auf neuartige antimikrobielle Arzneimittel haben wir den Extrakt aus antimikrobiellen Verbindungen aus F. cirrhosa untersucht, der eine signifikante Hemmwirkung zeigte (siehe Tabelle 4) und sich als ungiftig erwies. Die vorliegende Studie erarbeitet die detaillierte antimikrobielle Aktivität und führt eine In-silico-Studie zur besseren Validierung durch.

In der vorliegenden Studie betrugen die MHKs der standardmäßigen antimikrobiellen Wirkstoffe Ciprofloxacin und Amphotericin-B durch Brühenverdünnung 0,625, 1,25, 0,039, 0,625, 1,25, 3,12, 1,25, 2,5 bzw. 2,5 µg/ml. Die minimale Hemmkonzentration verschiedener Pflanzenextrakte zeigte bessere Ergebnisse als die in Tabelle 4 gezeigten Co-Kristalle.

Die LC-MS-Analyse ergab, dass F. cirrhosa-Zwiebelextrakte 88 bioaktive Verbindungen enthielten (Tabelle 3). Diese Phytoverbindungen wurden auf Aktivitäten gegen bakterielle und pilzliche Zielproteine untersucht. Die Docking-Studien wurden für Phytoliganden mit dem AutoDock Vina-Programm durchgeführt, um die Bindungsaffinitäten zu den Zielproteinen aufzuklären. Im Allgemeinen unter den 88 Phytoverbindungen. Alle sechs Proteinstrukturen, die mit mikrobiellen Wirkstoffzielen in Zusammenhang stehen, wurden an den am besten gescreenten Liganden Peonidin angedockt, der nach ADME-Screening auf der Grundlage verschiedener Parameter wie Löslichkeit, Toxizität, Absorption, Molekulargewicht und Ausscheidung erhalten wurde. Das Andocken wurde mit AutoDock Vina mit Chimera Plugin durchgeführt. Anschließend wurde der am besten angedockte Komplex anhand seiner Bindungsenergie untersucht. Die Bindung zwischen Ligand und Zielprotein wurde mit dem Biovia Discovery Studio sichtbar gemacht. Mit Biovia Discovery Studio wurden auch 2D-Interaktionsdiagramme visualisiert, die verschiedene Bindungen zwischen Ligand und Zielprotein zeigen. Peonidin (2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl) chromenylium-3,5,7-triol) zeigte die besten Bindungskonformationen mit den niedrigsten Bindungsenergiewerten bei Bakterien (− 8,2 kcal/mol), Pilzen (− 8,2 kcal/mol). mol) Zielproteine (Tabellen 5 und 6). Unsere Ergebnisse werden durch eine frühere Studie gestützt, die zeigte, dass die Protein-Ligand-Bindungsstabilität umso besser war, je niedriger der Bindungsenergiewert war44. Das Peonidin bildete im Vergleich zu anderen Verbindungen die besten Ligand-Protein-Komplexe mit sechs getesteten mikrobiellen Zielproteinen. Entsprechend der Bindungsenergien wurden die Andockergebnisse von Peonidin an Zielproteine geordnet. Die Docking-Ergebnisse von Peonidin mit Proteinen wie Dihydropterotensynthase, Penicillin-bindendem Protein, Elongationsfaktor Tu, 1, 3 Beta-Glykan, ABC-Transporter und Beta-Tubulin bestätigten, dass der Ligand eine höhere Affinität zum Penicillin-bindenden Protein aufweist ist ein Schlüsselregulator bei der Zellwandsynthese und -erhaltung (Abb. 6). Im Vergleich zu Ciprofloxacin zeigte das extrahierte natürliche Peonidinmolekül vergleichsweise die gleiche Andockeffizienz mit PBP innerhalb der Bindungstasche. Die angedockte Struktur wurde abgebildet, um die Ligandenwechselwirkungen mit den wichtigen Aminosäuren TYR A:561, ILE A:371, ASN A:397, PHE A:450 und GLN A:452 durch Vander-Waal-Kräfte sowie Wasserstoffbrücken zu veranschaulichen (Abb . 6). Die Bindungsaffinität der ausgewählten Verbindung gegenüber antibakteriellen und antimykotischen Proteinen ist in (Tabellen 5, 6, 7, 8) dargestellt.

(a) Der intermolekulare 2D- und 3D-Kontakt zwischen Ciprofloxacin und dem Pencillin-Bindungsprotein. Chemische Strukturen wurden mit ChemDraw Pro 16.0 Suite (PerkinElmer, USA) gezeichnet und mit dem Discovery Studio Visualizer (BIOVIA Discovery Studio 2020 Client) analysiert. (b) Der intermolekulare 3D- und 2D-Kontakt zwischen A) Dihydropteroat-Synthase B) Elongationsfaktor Tu und C) Penicillin-Bindungsprotein D) 1,3-Betaglykan E) Beta-Tubulin F) ABC-Transporter mit Peonidin. Chemische Strukturen wurden mit ChemDraw Pro 16.0 Suite (PerkinElmer, USA) gezeichnet und mit dem Discovery Studio Visualizer (BIOVIA Discovery Studio 2020 Client) analysiert.

Die am besten getroffene Verbindung wurde basierend auf der Bindungsaffinität und Transformation für molekulardynamische Studien in Betracht gezogen, um die Stabilität der Verbindung im Gegensatz zum Protein unseres Interesses zu analysieren. Für Simulationsstudien wurde das Desmond-Schrodinger-Suite-Programm für Rezeptorkomplexe verwendet, gefolgt von der RMSD des Proteins, die während des dynamischen Laufs für 100 Nanosekunden-Studien eine stabile Flugbahn aufwies. Eine Simulation von 100 Nanosekunden zeigt signifikante Umwandlungen und stabile Konformationen beim Vergleich von Protein-Ligand-RMSD, wie in Abb. 7 dargestellt. In dynamischen Studien zeigte RMSD eine schwankende Flugbahn bis 30 Nanosekunden, und es gibt weniger Schwankungen zwischen Liganden- und Proteinkonformationen ( Abb. 7). Insgesamt wurden sowohl der Rezeptor als auch der Ligand RMSD in einem stabilen Format beobachtet und sind in (Abb. 7, 8, 9, 10) zu sehen. Darüber hinaus wurden auch alle Aminosäurewechselwirkungen unserer Komplexe sowie die einzigartigen Wasserstoffbrückenbindungen wie TYR 561, ILE 371, ASN 397 usw. entsprechend analysiert.

Protein-Ligand-RMSD-Diagramm.

Protein-RMSF-Diagramm.

Protein-Ligand-Kontakte (VAL 72, ARG 254, THR 257, LYS 259, THR 275, ALA 279, GLY 28, LYS 283, LYS 285, SER 337, LYS 340, ARG 372, TRP 374, ASN 377, GLY 378, LYS 380, ARG 380, HIS 354, SER 394, ASNB 395, PHE 397, GLY 400, ASN 452, ASN 487, THR 488, ARG 490, ASP 492, PRO 521, VAL 522, TYR 523, GLY 524, TYR 525 , MET 526, TYR 527, ASN 525, HIS 529, SER 531, TYR 531, LYS 532, SER 534, GLY 548, THR 549, GLY 550, VAL 552, LYS 583, THR 565, TYR 566, PHE 568, GLU 570, HIS 593, TYR 594, SER 595, GLY 596, ILE 597, GLN 598, GLU 599, ASN 602, GLN 608, GLN 632, PRO 633, PRO 635, ASN 677).

Quadratische Abweichung, Gyrationsradius, intramolekulare Wasserstoffbrückenbindungen, molekulare Oberfläche, lösungsmittelzugängliche Oberfläche, polare Oberfläche, Diagramme der getroffenen Verbindung.

F. cirrhosa ist eine vielseitige Heilpflanze mit zahlreichen biologischen Eigenschaften in ihrer Natur. In der vorliegenden Studie ergab die Untersuchung von Petrolether-, Ethylacetat- und Methanolextrakten aus Zwiebeln von F. cirrhosa das Vorhandensein verschiedener Phytobestandteile, darunter Flavonoide und Kohlenhydrate, Saponine, Phenole, Alkaloide, Steroide und Terpenoide. Diese bioaktiven Phytobestandteile könnten für die therapeutische Wirkung verschiedener Extrakte von F. cirrhosa verantwortlich sein. Die Analyse erfolgte mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS), einer der am weitesten verbreiteten Techniken zur Trennung von Phytobestandteilen. Die LC-MS-Untersuchung von F. cirrhosa-Zwiebelextrakten ergab das Vorhandensein von 88 phytochemischen Verbindungen, die zu den medizinischen Eigenschaften dieser Pflanzenart beitragen könnten14. Solasodin (1S,2S,4S,5'R,6R,7S,8R,9S,12S,13R,16S)5',7,9,13tetramethylspiro[5oxapentacyclo[10.8.0.02,9.04,8.013,18]icos-18 -en-6,2'-piperidin]-16-ol) wurden aus Solanum dulcamara extrahiert und auf antimikrobielle Aktivität gegen die Testbakterien wie Staphylococcus aureus, Enterobacter aerogenes und Escherichia coli45,46 untersucht. Linarin (5-Hydroxy-2-(4-methoxyphenyl)-7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-[[(2R,3R,4R,5R, 6S)-3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxymethyl]oxan-2-yl]oxychromen-4-on), ein bioaktives Flavonglykosid, wurde in den Arten Cirsium, Micromeria und Buddleja häufig charakterisiert und zeigte vielversprechende Aktivitäten, insbesondere die heilende Wirkung bei Störungen des Zentralnervensystems (ZNS)47. Ebenso Puerarin (7-Hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-8-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] Chromen-4-on) ist der wichtigste bioaktive Inhaltsstoff, der aus der Wurzel der Pueraria lobata isoliert wird und in großem Umfang bei der Behandlung von Herz-Kreislauf- und zerebrovaskulären Erkrankungen, Diabetes und diabetischen Komplikationen, Osteonekrose, Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Endometriose und Krebs eingesetzt wird48. Ebenso wird Orientin aus verschiedenen Heilpflanzen isoliert und besitzt vielversprechende pharmakologische Aktivitäten, zu denen antioxidative, alterungshemmende, antivirale, antibakterielle, entzündungshemmende, gefäßerweiternde und kardioprotektive, strahlenschützende, neuroprotektive, antidepressiv wirkende, antiadipogenese und antinozizeptive Wirkungen gehören49. Es gibt viele Berichte über Peonidin, das apoptotische Wirkungen in Brustkrebszellen und therapeutische Anwendungen zeigt25,50. Darüber hinaus wurden Alkaloide wie Sinpeinin A (17), Imperialin-3-β-glucosid (18), Imperialin (7) und 3β-Acetyimperialin aus Bulbus F. cirrhosa beschrieben14. Aus den oben genannten Beweisen lässt sich erläutern, dass F. cirrhosa über ein enormes Potenzial an pharmakologischen Bestandteilen und therapeutischen Phytoverbindungen verfügt, die für verschiedene pharmakologische Wirkungen verantwortlich sind. Dies ist nach unserem besten Wissen der erste Bericht über die LC-MS-Untersuchung von F. cirrhosa-Zwiebelextrakten. Darüber hinaus untersuchte die vorliegende Studie die antimikrobielle Aktivität in vitro gegen verschiedene Bakterien- und Pilzstämme. Die Studie konzentrierte sich auf grampositive und gramnegative Bakterien, was die erhebliche Effizienz zeigt. Unter verschiedenen Pilz- und Bakterienstämmen wie E. coli, K. pneumonia, M. luteus, S. pneumonia, H. influenzae, N. mucosa und C. albicans wurde beobachtet, dass C. glabrata und C. Parapsilosis anfälliger sind Die Pflanzenextrakte mit den besseren minimalen Hemmkonzentrationswerten (Tabelle 4) sind im Vergleich zu den MHKs von Cokristallen (0,625, 1,25, 0,039, 0,625, 1,25, 3,12, 1,25, 2,0,5 und 2,5) bei einer Kombinationskonzentration. Darüber hinaus wird auch darauf hingewiesen, dass die Heilkräuter unterschiedliche Wirkmechanismen haben, was die identische antimikrobielle Wirkungsweise der Therapeutika im Gegensatz zu antimikrobiellen Wirkstoffen widerspiegelt10,51. Laut molekularem Docking zeigte Peonidin mit 6 verschiedenen Proteinen (Dihydropterotensynthase, Penicillin-bindendes Protein, Elongationsfaktor Tu, 1,3 Beta-Glykan, ABC-Transporter und Beta-Tubulin), dass Peonidin eine bessere Wechselwirkung und Bindungsbewertung mit dem Penicillin-bindenden Protein aufweist im Vergleich zu anderen Phytoverbindungen. Die Ergebnisse der Docking-Studie zeigten auch, dass verschiedene Energiequellen konsistent sind und zur Gesamtstärke der Bindungswechselwirkungen von Peonidin für jedes Zielprotein beitragen. Nach dem Andocken ergaben rechnergestützte molekulardynamische Simulationsstudien, dass verschiedene Aminosäuren mit Peonidin interagierten, was für die Synthese von Purinen und Pyrimidinnukleotiden erforderlich ist. Die meisten der interagierenden Aminosäuren wurden über Wasserstoffbrückenbindungen und Vander-Wall-Kräfte gebunden, wohingegen das Docking-Ergebnis mit Dihydropteroat-Synthase die damit verbundene Bindungsaffinität zu Zielrezeptoren aufdeckte. Die Flugbahn der molekulardynamischen Simulation wurde 100 Nanosekunden lang abgeschlossen und die RMSD- und RMSF-Diagrammwerte wurden analysiert. Der konstante Anstieg der RMSD-Werte im Laufe der Zeit weist darauf hin, dass das Protein regelmäßig seine native Konformation verlässt. Der höhere RMSF wurde in der Studie analysiert, wobei starke Wasserstoffbrückenbindungen festgestellt wurden, wobei überwiegend polare Aminosäuren den maximalen Peak aufwiesen.

Die vorliegende Untersuchung konzentrierte sich auf die erstmalige Identifizierung verschiedener bioaktiver Verbindungen aus den Zwiebelextrakten von F. cirrhosa mittels LC-MS-Analyse. Diese Verbindungen sind für die unterschiedlichen therapeutischen und pharmakologischen Eigenschaften verantwortlich. Wir haben auch Beweise für die antimikrobielle Aktivität von Zwiebelextrakten von F. cirrhosa vorgelegt. Darüber hinaus erklärte die vorliegende Studie auch die Rolle der Peonidin-Verbindung gegen antimikrobielle Proteine wie Dihydropteroat-Synthase (DHPS), Penicillin-bindendes Protein (PBP), Elongationsfaktor-Tu (Eu-Tu), 1,3-β-Glykan und ABC Transporter und Beta-Tubulin. Unter allen Bakterien- und Pilzarten zeigte Peonidin den besten Docking-Score gegenüber PBP und wurde anschließend dynamischen Simulationsstudien unterzogen, um die Stabilität sowie die RMSD- und RMSF-Werte in Bezug auf Protein-Ligand-Transformationen zu untersuchen. Der Einsatz der Peonidin-Verbindung könnte es uns ermöglichen, ein wirksames Medikament gegen pathogene Bakterien und Pilzkrankheiten zu entwickeln. Darüber hinaus zeigten ADMET-Studien (Arzneimittelähnlichkeit) die höchsten Arzneimittelähnlichkeitseigenschaften der untersuchten Verbindung, was darauf hindeutet, dass die Peonidin-Verbindung als vielversprechender Mikrobail-Arzneimittelkandidat fungieren kann. Weitere Untersuchungen zur Bestimmung der Bioaktivität und des Toxizitätsprofils sowie klinische Studien sind für die Entdeckung von Breitbandarzneimitteln erforderlich.

American Type Culture Collection Center

Koloniebildende Einheiten

Ciprofloxin

Minimale Hemmkonzentration

Sammelzentrum für mikrobielle Kulturen

Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Massenspektroskopie

Ultrahochleistungs-Flüssigkeitschromatographie

Zentrum für Biodiversität und Taxonomie

Institut für Mikrobielle Technologie

Penicillin-bindendes Protein

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Proteindatenbank

Mittlere quadratische Abweichung

Effektive quadratische Schwankung

Molekulares Andocken

Molekulardynamische Simulation

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Die Autoren danken dem Molecular Biology Laboratory, Division of Veterinary Biochemistry, SKUAST-K, Srinagar, für ihre Unterstützung bei der Durchführung antimikrobieller Aktivitäten. Mustafa F. Alkhanani möchte der AlMaarefa-Universität, Riad, KSA, seinen Dank für die Bereitstellung der Finanzierung aussprechen (TUMA-2021-53).

Die Finanzierung erfolgte durch das Science and Engineering Research Board (SERB), Department of Science and Technology, Govt of India siehe Grant No. TAR/001213/2018 an Dr. Manzoor Ahmad Mir.

Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: Basharat Ahmad Bhat, Wajahat Rashid Mir und Bashir Ahmad Sheikh.

Abteilung für Bioressourcen, School of Biological Sciences, Universität Kaschmir, Srinagar, 190006, Indien

Basharat Ahmad Bhat, Wajahat Rashid Mir, Bashir Ahmad Sheikh und Manzoor Ahmad Mir

Hochschule für angewandte medizinische Wissenschaften, Almaarefa-Universität, Riad, 11597, Königreich Saudi-Arabien

Mustafa Alkanani

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MAM, Konzeptualisierung, entworfene Forschungsarbeit, Interpretation der Daten, BAB, WRM führten die Experimente durch, analysierten die Daten, schrieben das Manuskript; MAM, MA, BAB, BAS und WRM analysierten die Daten, überprüften, redigierten das Manuskript und genehmigten die endgültige Version des Manuskripts. Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Korrespondenz mit Manzoor Ahmad Mir.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 13. Dezember 2021

Angenommen: 07. April 2022

Veröffentlicht: 04. Mai 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-10796-7

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Angewandte Mikrobiologie und Biotechnologie (2022)

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