Die Kristallstruktur von Pneumolysin bei einer Auflösung von 2,0 Å enthüllt die molekulare Packung des Prä

Scientific Reports Band 5, Artikelnummer: 13293 (2015) Diesen Artikel zitieren

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Pneumolysin ist ein cholesterinabhängiges Cytolysin (CDC) und Virulenzfaktor von Streptococcus pneumoniae. Es tötet Zellen ab, indem es Poren bildet, die aus oligomeren Ringen in cholesterinhaltigen Membranen zusammengesetzt sind. Kryo-EM hat die Strukturen der an die Membranoberfläche gebundenen Präporen- und Insertionsporen-Oligomere aufgedeckt. Die molekularen Kontakte, die diese Oligomere vermitteln, sind jedoch unbekannt, da keine hochauflösenden Informationen verfügbar sind. Hier haben wir die Kristallstruktur von Pneumolysin voller Länge mit einer Auflösung von 1,98 Å bestimmt. In der Struktur zeigen Kristallkontakte die wahrscheinlichen Wechselwirkungen, die die Polymerisation auf der Zellmembran und die molekulare Packung des Vorporenkomplexes ermöglichen. Bei Mutanten, die diese intermolekularen Kontakte unterbrechen, wird die hämolytische Aktivität aufgehoben, was ihre Bedeutung für die Porenbildung unterstreicht. Allein eine zusätzliche Kristallstruktur der membranbindenden Domäne legt nahe, dass Änderungen in der Konformation einer tryptophanreichen Schleife an der Basis des Toxins Monomer-Monomer-Wechselwirkungen bei der Membranbindung fördern, indem sie neue Kontakte schaffen. Bemerkenswert ist, dass Reste an der Grenzfläche bei anderen Mitgliedern der CDC-Familie konserviert sind, was auf einen gemeinsamen Mechanismus für den Poren- und Vorporenaufbau schließen lässt.

Das cholesterinabhängige Cytolysin (CDC), Pneumolysin1, ist ein Virulenzfaktor des menschlichen Krankheitserregers Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken)2, der Hauptursache für bakterielle Lungenentzündung und ein Hauptauslöser von Meningitis und Septikämie sowie schwächenden Krankheiten wie Mittelohrentzündung und septischer Erkrankung Arthritis, Keratitis und Sinusitis3. Es kommt in nahezu allen Pneumokokken-Isolaten vor und spielt eine Schlüsselrolle bei der Kolonisierung, Invasion und Entzündung von Bakterien4,5,6. Ein zentrales Merkmal des Toxins ist die Bildung von Transmembranporen in cholesterinhaltigen Membranen7, die je nach Konzentration die Zellfunktion lysieren oder stören8,9,10. Pneumolysin und andere CDCs binden über eine tryptophanreiche Schleife und ein Threonin-Leucin-Paar innerhalb einer Membranbindungsdomäne an der Basis des Toxins an Säugetiermembranen11,12. Es wurde vermutet, dass die tryptophanreiche Schleife bei der Verbindung mit der Membran aus dem Körper des Toxins herausspringt12. Alle drei Tryptophane sind an der Membranbindung beteiligt, aber Trp433 und Trp435 sind besonders wichtig13,14. Sobald die Monomere an die Membran gebunden sind, oligomerisieren sie und bilden einen Präporenkomplex, der anschließend eine Reihe komplexer Strukturübergänge durchläuft, um eine Transmembranpore zu bilden, die typischerweise aus 30–50 Untereinheiten besteht. Die Strukturen der Vorporen- und Insertion-Poren-Oligomere wurden durch Kryo-EM bei ~28 Å bestimmt und diese Strukturen zeigen zusammen mit einer aktuellen Analyse des verwandten CDC, Suilysin, dass diese Porenbildung dem vertikalen Kollaps der Vorpore folgt Struktur mit zwei verlängerten Beta-Haarnadeln, die die Membran durchdringen und die große Beta-Fass-Porne bilden7,15.

Obwohl für mehrere CDCs hochauflösende Röntgenstrukturen bestimmt wurden, erwies sich Pneumolysin als schwer fassbar. Folglich stützte sich die Struktur-Funktions-Analyse auf Modelle, die auf den Strukturen der anderen CDC-Toxine basieren. Entscheidend ist, dass der Mangel an hochauflösenden Daten bedeutet, dass die Wechselwirkungen, die es den Pneumolysin-Monomeren ermöglichen, sich zusammenzupacken und die Poren- und Vorporenkomplexe zu bilden, nicht bekannt sind. In dieser Arbeit haben wir die Struktur von Pneumolysin mit einer Auflösung von 1,98 Å bestimmt. Die Packungsanordnung nebeneinander im Kristall zeigt die Packung der Monomere im Vorporenkomplex. Zusätzliche Struktur- und Mutagenesedaten haben Rückstände identifiziert, die wahrscheinlich zur Oligomerisierung während der Vorporenbildung beitragen.

Pneumolysin voller Länge und eine verkürzte Form, die die Membranbindungsdomäne (Domäne 4) umfasst, wurden durch Expression in E. coli hergestellt und durch Affinitäts- und Gelfiltrationschromatographie gereinigt. Kristalle des Toxins voller Länge wurden bei 4 °C und einem pH-Wert von 8,5 gezüchtet. Die besten Kristalle wurden aus Proteinen erhalten, die die Substitutionen Asp385Asn und Cys432Ala enthielten. Keine der Mutationen verhindert die Porenbildung16,17. Die asymmetrische Einheit enthielt ein einzelnes Molekül mit der charakteristischen Vier-Domänen-Struktur eines CDC, wobei drei nicht zusammenhängende Domänen (Domänen 1–3) über die riemenartige Domäne mit der C-terminalen Membranbindungsdomäne (Abb. 1A) verbunden waren 2. Kristalle der membranbindenden Domäne wurden bei Raumtemperatur gezüchtet und enthielten zwei Moleküle in der asymmetrischen Einheit. Beide verfeinerten Modelle weisen eine gute Stereochemie auf (Tabelle 1), wobei 95 % und 93 % der Reste innerhalb der von Ramachandran bevorzugten Regionen liegen.

Domänenstruktur von Pneumolysin und die wahrscheinlichen Veränderungen bei der Membranbindung.

(A) Die Domänen 1, 2 und 3 sind zusammenhängend und über Domäne 2 mit der C-terminalen Membranbindungsdomäne (Domäne 4) verbunden. (B) Überlagerung der Membranbindungsdomänen des Volllängen-Pneumolysins (PLY), Pneumolysin-Domäne 4 (PLY D4) und Perfringolysin O (PFO; PDB: 1PFO12;) Strukturen. Die Strukturen offenbaren die wahrscheinlichen Veränderungen, die bei der Membranbindung auftreten. Bemerkenswerterweise klappt die tryptophanreiche Schleife nach außen und unten (Pfeil), wodurch Trp433 freigelegt wird, um die Bindung an die Membran zu ermöglichen.

Die tryptophanreiche Schleife ragt von der Basis der Domäne 4 in der Struktur von Pneumolysin voller Länge hervor und spiegelt die wahrscheinliche Membranbindungskonformation wider (Abb. 1B). Bemerkenswert ist, dass zwei der Tryptophanreste, Trp433 und Trp435, von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie für die Membranbindung und Zelllyse13 wichtig sind, nach außen ragen und somit in der Lage sind, Wechselwirkungen mit einer Lipiddoppelschicht zu ermöglichen. Im Gegensatz dazu ist die Schleife in der Struktur von Domäne 4 allein teilweise zurückgefaltet (Abb. 1B) und in der zuvor bestimmten Struktur von Perfringolysin O12 vollständig gegen den Körper von Domäne 4 zurückgebogen. Zusammengenommen stimmen die Strukturen mit der vorherigen Annahme überein, dass die Schleife nach außen und unten springt, wenn das Toxin an die Membran einer Säugetierzelle bindet (Abb. 1B)12.

In der Struktur von Pneumolysin voller Länge ist Domäne 4 um ~30° relativ zur Ebene der Längsachse der Domänen 1–3 versetzt, sodass das Toxin von der Seite einem gebogenen Stab ähnelt (Abb. 2A). Die relative Position von Domäne 4 unterscheidet sich in den verfügbaren Strukturen von CDCs. Beispielsweise ist es in der Kristallstruktur von Perfrigolysin O (PDB: 1PFO12;) um etwa 15 Å verschoben und um etwa 25° verdreht, während es in Intermedilysin (18; Abb. 2A) noch weiter (um etwa 40°) versetzt ist ). Diese Unterschiede deuten auf eine Flexibilität an der Domäne 2-Domäne 4-Verbindung hin, die es dem Toxin ermöglichen würde, an der Membranoberfläche anzudocken und sich zu verdichten, um den Präporenkomplex zu bilden.

Die Packung der Monomere im Pneumolysinkristall zeigt die Packung des Vorporenkomplexes.

(A) Kristallstrukturen von Pneumolysin (PLY), Intermedilysin (ILY) und Perfringolysin (PFO) zeigen Unterschiede im Winkel zwischen den Domänen 1–3 und Domäne 4. (B) Überlagerung zweier angepasster Modelle in die KryoEM-Dichte vor der Pore (graue Oberfläche). ; PDB: 2BK27) mit benachbarten Monomeren aus der Kristallstruktur (Cyan und Grün). Die RMS-Abweichung betrug 4,90 Å (über 849 Cα-Atome).

Ein auffälliges Merkmal von Pneumolysinkristallen ist, dass sich die Monomere im Kristallgitter Seite an Seite anordnen und so der molekularen Packung des Vorporenkomplexes ähneln. Die Überlagerung zweier Pneumolysinmoleküle aus der Kristallstruktur mit benachbarten Monomeren aus der Kryo-EM-Struktur (PDB: 2BK27) ergibt eine RMS-Abweichung von 4,90 Å (über 849 Cα-Atome; Abb. 2B). Am bemerkenswertesten ist, dass sich Domäne 4 im Verhältnis zum Rest des Toxins in der richtigen Position für die Membranbindung befindet (Abb. 2B). Die Grenzfläche zwischen Pneumolysinmolekülen entsteht durch die konkave Fläche eines Monomers, die sich an der konvexen Fläche seines Nachbarn anlagert. Obwohl es fast die gesamte Längsachse des Toxins umfasst, interagiert nur ein relativ kleiner Teil der Reste (Abb. 3A). Insbesondere konnten diese anhand der KryoEM-Strukturen nicht vorhergesagt werden, da die Auflösung zu gering ist, um die Seitenketten zu erkennen. Intermolekulare Kontakte werden von allen vier Domänen hergestellt, betreffen jedoch hauptsächlich die Domänen 1 und 4. Es besteht eine gewisse Ladungskomplementarität zwischen den konvexen und konkaven Flächen, wobei erstere negativer und letztere positiver geladen sind (Abb. 3A). Die Grenzfläche umfasst 44 Reste auf der konkaven Fläche und 41 Reste auf der konvexen Fläche mit einer gesamten vergrabenen Oberfläche von 939,6 Å2 bzw. 962,8 Å2. Obwohl die meisten Reste an der Grenzfläche polar sind, gibt es relativ wenige polare intermolekulare Wechselwirkungen: Salzbrücken zwischen Asp8 und Arg226 und Glu434 und Arg399 sowie Wasserstoffbrückenbindungen zwischen der Seitenkette von Asn339 und der Carbonylgruppe von Pro87 sowie zwischen der Hydroxylgruppe von Tyr461 und den Amin- und Carbonylgruppen von His407. Der Hauptbeitrag zur Oligomerisierung von Monomeren auf der Membran dürfte daher die Oberflächenkomplementarität sein, die zum Ausschluss von Wasser führt. Bemerkenswert ist, dass von den 85 vergrabenen Resten 41 identisch sind und 63 in mindestens drei der anderen CDCs konserviert sind, für die Strukturen verfügbar sind, was darauf hindeutet, dass die Schnittstelle in anderen CDCs wahrscheinlich relativ gut konserviert ist (Abb. 3B). . Diese Schlussfolgerung wird durch einen Vergleich der Pneumolysinstruktur mit den Kristallstrukturen von Intermedilysin19 und Listeriolysin O20 gestützt, die ebenfalls nebeneinander im Kristall gepackt sind. Bemerkenswerterweise umfassen Kontakte in den drei Strukturen äquivalente Regionen der CDC-Polypeptide und viele der interagierenden Reste bleiben konserviert (Abb. 3B).

Die konservierte Grenzfläche zwischen benachbarten Pneumolysin-Monomeren.

(A) Die konvexen und (B) konkaven interagierenden Oberflächen zeigen das elektrostatische Potential. Durch die Wechselwirkung vergrabene Regionen sind gelb und violett schattiert und wichtige Rückstände sind gekennzeichnet. (Unteres Feld) Ausrichtung der Sequenz von Pneumolysin mit anderen CDCs. Rückstände, die die Grenzflächen in den Kristallstrukturen von Pneumolysin (PLY), Intermedilysin (ILY) und Lysteriolysin (LLO) bilden, sind wie in Teil (A und B) oben schattiert. Reste, die in Perfringolysin O (PFO), Anthrolysin O (ALO) und Suilysin (SLO) konserviert sind, sind entsprechend schattiert. Ähnliche Rückstände sind grün.

Um zu testen, ob die im Kristall beobachteten intermolekularen Kontakte für die Aktivität des Toxins wichtig sind, wurden Mutationen in Reste eingeführt und die resultierende zytolytische Aktivität mithilfe eines einfachen hämolytischen Tests gemessen. Insgesamt wurden 18 einzelne Mutationen an oberflächenexponierten Rückständen vorgenommen. Die Mutationen Arg399Ala und Glu434Ala wurden entwickelt, um die Salzbrücke zwischen benachbarten Membranbindungsdomänen zu zerstören, und Tyr461Phe und Tyr461Ala, um die Wasserstoffbindung zwischen Tyr461 und der Hauptkette von His407 zu verhindern. Zusätzlich wurden Mutationen eingeführt, um die hydrophobe Packung zu zerstören, indem Seitenketten entfernt wurden, die gegen das benachbarte Monomer packen, oder indem große geladene Gruppen (Glu oder Arg) an der Grenzfläche eingeführt wurden. Leu11Arg, Ser68Glu, Asn86Arg, Thr88Glu, Arg147Ala, Asp205Arg Arg226Ala Thr304Arg, Asp338Ala, Ser68Glu, Asn86Arg, Arg147Glu, Asp338Arg wurden entwickelt, um die Schnittstelle an der Spitze des Toxins (Domänen 1–3) zu zerstören, und Arg437Ala, um die Domäne 4/Domäne 4 zu zerstören Schnittstelle. Obwohl sie meist polarer Natur sind, bilden diese Reste keine intermolekularen polaren Kontakte, sondern schließen Wasser an der Grenzfläche aus. Drei Doppelmutanten wurden auch mit Mutationen in Domäne 4 erzeugt: Arg339Ala + Glu434Ala; Glu434Ala + Tyr461Ala; und Glu434Ala + Arg437Ala. Wichtig ist, dass mit Ausnahme von Arg147, das an der Grenze der Domänen 1/3 liegt, und Thr304 innerhalb der Domäne 3 die Mutagenese auf Reste in den Domänen 1 und 4 beschränkt war, die bei der Porenbildung relativ geringe Positionsänderungen erfahren. Regionen, die großen Konformationsänderungen unterliegen, einschließlich der Reste 155–186 und 253–285, die die membrandurchspannenden β-Haarnadeln bilden, und Domäne 2, die rotiert, damit die Haarnadeln die Membran durchdringen können, wurden ausgeschlossen, um sicherzustellen, dass die Mutationen die Pore nicht verhinderten Bildung selbst. Alle Mutanten wurden wie für Wildtyp-Pneumolysin hergestellt und gereinigt. Wie bei Wildtyp-Proteinen eluierten sie als einzelne Peaks aus einer Gelfiltrationssäule, was Monomeren entsprach, und Zirkulardichroismus und Fluoreszenzspektroskopie (Abb. 4B) bestätigten, dass sie gefaltet waren.

Hämolytische Aktivitäten und biophysikalische Eigenschaften mutierter Pneumolysine.

(A) Hämolyse von Schaferythrozyten durch ausgewählte Pneumolysinmutanten. (B) Fluoreszenzspektren von gefaltetem und ungefaltetem Pneumolysin (in 2M Guanidin-HCl) und Pneumolysin mit Liposomen. Die Fluoreszenzspektren aller Mutanten waren mit denen des Wildtyps vergleichbar und zeigten ähnliche Veränderungen hinsichtlich der Fluoreszenzintensität und λem, max. (C,D), Denaturierung von Wildtyp- und mutierten Pneumolysinen, gemessen durch Änderungen der Fluoreszenzintensität (C) und λem, max (D). Der durch die Änderung von λem,max gemessene Entfaltungsübergang entsprach ungefähr der in (C) beobachteten Abnahme der Fluoreszenz. (E) Cholesterin-vermittelte Hemmung der Hämolyse durch Wildtyp- und mutierte Pneumolysine. Die Daten sind Durchschnittswerte aus sechs Messungen.

Fast alle Mutationen verringerten die Fähigkeit von Pneumolysin, rote Blutkörperchen von Schafen zu lysieren, jedoch in unterschiedlichem Ausmaß (Abb. 4A und 5A sowie Tabelle 2). Die auffälligsten Effekte wurden bei den Einzelmutationen Asn339Arg und Asp205Arg beobachtet, die bei den höchsten getesteten Konzentrationen (10 μM) keine Lyse der Schaferythrozyten bewirkten, was eine >3000-fache Abnahme der hämolytischen Aktivität widerspiegelt (Tabelle 2). Beide Reste befinden sich in der Mitte der Bindungsschnittstelle innerhalb der Domäne 1 (Abb. 5A). Andere Mutationen in Domäne 1 führen ebenfalls zu starken Aktivitätsrückgängen, darunter Thr88Glu, Arg147E und Arg226Ala und in geringerem Maße Ser68Glu und Asn86Arg. Die Mutation Thr304Arg innerhalb der Domäne 3 führte ebenfalls zu einem starken Rückgang der Aktivität (300-fach). In der Struktur ist die Threonin-Seitenkette Teil eines β-Strangs, der sich an den Kohlenwasserstoffteil der Seitenkette von Lys268 anschließt. Dieser Strang kann bei der Oligomerisierung auf der Membran verdrängt werden, damit sich die Monomere zu einem Ring zusammenpacken können. Nur drei Mutationen hatten einen relativ geringen Einfluss auf die Hämolyse (≤ 2-fach): Leu11Arg, Asp338Ala und V341Arg. Interessanterweise befinden sich alle drei Reste im hinteren Bereich der Domäne 1, die den äußeren Teil des Präporenrings in Richtung des Umfangs der Bindungsschnittstelle bildet. Die Häufung dieser Reste lässt vermuten, dass dieser Bereich des Toxins für die Oligomerisierung möglicherweise weniger wichtig ist, was möglicherweise eine gewisse Flexibilität widerspiegelt.

Beiträge von Rückständen zur hämolytischen Aktivität, die durch ortsspezifische Mutagenese aufgedeckt wurden.

(A) Konvexe (L) und konkave Flächen (R) von Pneumolysin, die die Positionen der Mutationen und die relativen Veränderungen der hämolytischen Aktivität zeigen. (B) Packung zwischen benachbarten Membranbindungsdomänen in der mutmaßlichen Membranbindungskonformation von Pneumolysin (Pneumolysinstruktur in voller Länge). Glu434 bildet eine Salzbrücke mit Arg399 des benachbarten Moleküls und richtet außerdem Arg437 so aus, dass es einen Teil der Monomer-Monomer-Grenzfläche bildet. (C) Die Substitution mit der Struktur der Domäne 4 (orange) zeigt, dass das polare Netzwerk verloren geht, wenn die tryptophanreiche Schleife ganz oder teilweise zurückgezogen wird, wie es in Lösung vorhergesagt wird. Auf diese Weise würde die Membranbindung die Oligomerisierung von Pneumolysinmonomeren auf der Zelloberfläche fördern.

Mutationen innerhalb der Domäne 4 reduzierten auch die hämolytische Aktivität von Pneumolysin. Der Ersatz von Tyr461 durch einen Alaninrest führte zu einer fünffachen Verringerung der Aktivität, wohingegen die Tyr461Phe-Mutation nur geringe Auswirkungen hatte, was darauf hindeutet, dass der Ausschluss von Wasser an der Monomergrenzfläche wichtiger ist als die Wasserstoffbrückenbindungen zu His407. Eine Störung des kleinen polaren Netzwerks, an dem Glu434 und Arg437 eines Monomers und Gln402 und R399 des benachbarten Monomers beteiligt sind (durch Mutationen Arg437Ala, Glu434Ala oder Arg399Ala), reduzierte die hämolytische Aktivität um das 6- bis 10-fache. In der Kristallstruktur bildet Glu434 nicht nur eine Salzbrücke mit Arg399, sondern interagiert auch mit Arg437, das wiederum einen Teil der Bindungsschnittstelle bildet, indem es gegen das benachbarte Monomer gepackt wird. Interessanterweise sind diese Wechselwirkungen nur möglich, wenn die tryptophanreiche Schleife in der mutmaßlichen Membranbindungskonformation nach außen geklappt wird. Wenn die Schleife zurückgefaltet wird, wie in der Struktur der Domäne 4 oder in der Struktur von Perfringolysin O (Abb. 1B), kontaktiert Glu434 nicht mehr Arg399 oder Arg437 (Abb. 5B). Dieser Mechanismus würde dazu beitragen, die Oligomerisierung auf der Membranoberfläche zu stabilisieren, jedoch nicht in Lösung. Wie erwartet ist die Doppelmutante Glu434Ala + Arg437Ala noch stärker gestört als die Einzelmutationen (30-facher Aktivitätsverlust). Die anderen Doppelmutationen sind in ähnlicher Weise betroffen und weisen eine 20- bis 30-fache Abnahme der Aktivität auf (Tabelle 1).

Um zu bestätigen, dass die Mutationen die hämolytische Aktivität nicht durch Destabilisierung oder Veränderungen der Membranbindung beeinträchtigten, verglichen wir die Stabilitäten und Membranbindungseigenschaften von fünf der Mutanten mit der größten Abnahme der hämolytischen Aktivität: Asn339Arg, Asp205Arg, Glu434Ala, Arg147Glu und der Doppelmutante Glu434Ala + Tyr461Ala. Die Stabilitäten wurden durch Guanidin-HCl-Denaturierung untersucht und durch Fluoreszenz gemessen. Pneumolysin weist ein komplexes Denaturierungsprofil auf, das wahrscheinlich seine Multidomänenstruktur widerspiegelt, in der die Fluoreszenzintensität im Bereich von 0,75–1,25 M Guanidin-HCl zunahm und dann von 1,25–1,75 M abnahm. Weitere Erhöhungen der Konzentration des Denaturierungsmittels führten zu keinen weiteren Veränderungen. Dies deutet darauf hin, dass Pneumolysin bereits vollständig entfaltet war (Abb. 4C). Die Abnahme der Fluoreszenzintensität ging mit einer Verschiebung des λem, max von 347 nm auf 354 nm einher, was damit übereinstimmt, dass vergrabene Tryptophanreste dem polaren Lösungsmittel ausgesetzt wurden. Die Auftragung von λem, max gegen die Konzentration von Guanidin-HCl ergab einen einfachen Zweizustandsübergang, bei dem der Mittelpunkt bei ~1,4 M Guanidin-HCl lag (Abb. 4D). Die fünf Mutanten hatten alle vergleichbare Denaturierungskurven sowohl in Bezug auf die Fluoreszenzintensität (Abb. 4C) als auch auf λem, max (Abb. 4D), was darauf hinweist, dass sie durch die Mutationen nicht destabilisiert werden.

Um die Membranbindung zu untersuchen, fügten wir Pneumolysin zu cholesterinhaltigen Liposomen hinzu und verwendeten Fluoreszenz, um auftretende Veränderungen zu erkennen. Die Bindung von Liposomen durch das Wildtyp-Toxin führte zu einem geringen Anstieg (~15 %) der Fluoreszenzintensität, der mit einer Abnahme des λem, max von 347 auf 342 nm einherging (Abb. 4B), was vermutlich auf den Tryptophan-Gehalt zurückzuführen ist Die Schleife wird in der hydrophoben Lipiddoppelschicht vergraben. Alle Mutanten mit reduzierter hämolytischer Aktivität wurden auf diese Weise getestet und zeigten vergleichbare Fluoreszenzveränderungen wie das Wildtyp-Toxin, sowohl hinsichtlich der Fluoreszenzintensität als auch λem, max. Obwohl es in diesem Assay nicht möglich war, die Bindungsaffinitäten zu messen, deuten diese Daten darauf hin, dass die mutierten Toxine auf ähnliche Weise wie das Wildtyp-Toxin an cholesterinhaltige Lipiddoppelschichten binden. Um die Lipidbindung weiter zu untersuchen, wurde ein hämolytischer Hemmungstest für die drei Mutanten verwendet, die eine gewisse verbleibende hämolytische Aktivität zeigten. In diesem Test wurde Pneumolysin vor der Zugabe von Schaferythrozyten mit steigenden Cholesterinkonzentrationen inkubiert. Cholesterin hemmte die Hämolyse durch Wildtyp-Pneumolysin mit einem IC50 von 20 nM. Für die Mutanten Glu434Ala, Arg147Glu und Glu434Ala + Tyr461Ala wurden IC50-Werte von 9, 14 und 15 nM gemessen, was darauf hindeutet, dass sie Cholesterin mit vergleichbaren Affinitäten zum Wildtyp-Toxin binden. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass der Verlust der hämolytischen Aktivität nicht durch Veränderungen der Stabilität oder der Cholesterinbindung verursacht wird. Daher stören die Mutationen wahrscheinlich die intermolekulare Packung von Pneumolysin-Monomeren auf der Membranoberfläche vor der Porenbildung.

Es wurde gezeigt, dass Pneumolysin in Lösung spontan oligomerisiert, jedoch nur bei hohen Proteinkonzentrationen, was schwache Wechselwirkungen zwischen Monomeren zeigt, selbst in Abwesenheit einer cholesterinhaltigen Lipiddoppelschicht21,22. Wir schlagen vor, dass diese Wechselwirkungen in den Kristallen von Pneumolysin eingefangen wurden, und diese Schlussfolgerung wird durch die Strukturen von Intermediolysin und Listeriolysin O gestützt, die sich auf ähnliche Weise zusammenlagern. Die Struktur zeigt Form- und Ladungskomplementarität zwischen benachbarten Pneumolysin-Monomeren, bei denen eine konkave, stärker negativ geladene Oberfläche an einer konvexen, positiveren Seite anliegt. Die vergrabene Oberfläche ist im Vergleich zu stabilen Protein-Protein-Komplexen23 bescheiden, wie man es von einem Protein erwarten würde, das in physiologischen Konzentrationen überwiegend monomer ist. Bei der Bindung an eine Lipiddoppelschicht würde jedoch eine Diffusion in nur zwei möglichen Ebenen die Oligomerisierung zur Bildung der Vorpore begünstigen. Die Selbstassoziation wird wahrscheinlich durch zusätzliche Wechselwirkungen weiter begünstigt, die erst dann auftreten, wenn Pneumolysin-Monomere an die Membranoberfläche gebunden haben. Daher ist das kleine polare Netzwerk mit Glu434 und Arg437 eines Monomers und Gln402 und Arg399 seines Nachbarn nur möglich, wenn das Tryptophan-reiche in der mutmaßlichen Membranbindungskonformation nach außen kippt (Abb. 5B). In Lösung kommt Glu434 nicht mit Arg437 in Kontakt und kann daher nicht zur Monomer-Monomer-Packung beitragen.

Monomere sind in der Kristallstruktur parallel, müssen jedoch auf der Zellmembran leicht versetzt sein, um die ringförmigen Vorporen- und Porenoligomeren zu erzeugen. Darüber hinaus variieren die Poren in der Größe, typischerweise zwischen 30 und 50 Untereinheiten, sodass eine gewisse Toleranz in der intermolekularen Packung bestehen muss (von einem Versatz von 12° bei einem 30mer bis 7,2° bei einem 50mer). Bemerkenswert ist, dass die meisten Packungswechselwirkungen im Kristall im zentralen Teil der Bindungsgrenzfläche stattfinden (und nicht an den Rändern, wo die Wechselwirkung tendenziell blockiert würde) und daher wahrscheinlich einen gewissen Spielraum beim Winkel zwischen den Monomeren lassen.

Die meisten Kontakte zwischen Pneumolysin-Monomeren finden zwischen Resten in den Domänen 1 und 4 am oberen bzw. unteren Ende des Toxins statt. Es wird angenommen, dass diese Domänen ihre Konformation während der Porenbildung am wenigsten ändern, wobei Domäne 4 durchgehend als fester Membrananker dient und Domäne 1 als Brücke zwischen Domäne 2 fungiert, die sich dreht, wenn die Vorpore zusammenfällt, um die Pore und Domäne 3 zu bilden , das sich neu anordnet, um die β-Haarnadeln zu bilden, die die Membran durchdringen7. Daher ist es wahrscheinlich, dass zumindest einige der intermolekularen Kontakte, an denen die Domänen 1 und 4 beteiligt sind, im Porenzustand erhalten bleiben, wodurch die Oligomere während und nach der großen Konformationsänderung stabilisiert werden.

Kürzlich hat sich herausgestellt, dass es sich bei Pneumolysin und mehreren anderen CDC um Lektine handelt, die wahrscheinlich über duale Rezeptoren auf Wirtszellen verfügen, an denen sowohl ein Kohlenhydratligand als auch Cholesterin beteiligt sind24. Pneumolysin bindet an Sialyl-Lewis X auf roten Blutkörperchen. Bezeichnenderweise sind die mutmaßlichen kohlenhydratbindenden Reste, die in dieser Studie identifiziert wurden, nicht an den in unserer Arbeit identifizierten intermolekularen Wechselwirkungen beteiligt oder werden von diesen verdeckt, was eine gleichzeitige Rezeptorbindung und Vorporenbildung auf der Membranoberfläche ermöglicht.

Pneumolysin ist aufgrund seiner Bedeutung für die Pathogenität von Pneumokokken und seiner Konservierung in den verschiedenen Serotypen von S. pneumoniae ein Ziel für Inhibitoren zur Behandlung von Pneumokokken-Erkrankungen. Die Unterbrechung der Pneumolysin-Oligomerisierung ist eine attraktive potenzielle Strategie für die zukünftige Entwicklung solcher Inhibitoren und die hier beschriebene Struktur bildet die Grundlage für rationale Ansätze.

Das für Pneumolysin kodierende Gen vom Serotyp D39 wurde durch PCR amplifiziert und in den Polylinker eines modifizierten pET-basierten Expressionsvektors kloniert. Das Protein wurde mit einem N-terminalen His6-Tag synthetisiert. Frisch transformierte E. coli BL21 (DE3) wurden bis zu einer OD600 von 0,6–0,8 gezüchtet, mit 0,1 mM IPTG induziert und bei 18 °C unter Schütteln bei 220 U/min über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden durch 15-minütige Zentrifugation bei 3.500 g und 4 °C geerntet und in Lysepuffer (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 20 mM Imidazol und 1 % v/v Tween 20 bei pH 7,5) mit einem Proteaseinhibitor resuspendiert Tablette (Roche). Die Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung lysiert und Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation entfernt. Der Überstand wurde dann auf eine Nickel-Sepharose-Säule (5 ml; GE Healthcare) geladen und mit Lysepuffer voräquilibriert. Nach dem Beladen wurde die Säule mit 50 ml Lysepuffer ohne Tween 20 gewaschen und Pneumolysin wurde unter Verwendung eines linearen Imidazolgradienten zwischen 0 und 1 M eluiert. Pneumolysin wurde durch Gelfiltration unter Verwendung einer Superdex 200 16/60-Säule in 20 mM Tris weiter gereinigt -HCl bei pH 7,5. Domäne 4 wurde als Maltose-bindende Proteinfusion exprimiert und durch Affinitätschromatographie auf einer Amylose-Sepharose-Säule (1 ml; GE Healthcare) gereinigt. Domäne 4 wurde durch Verdau über Nacht mit TEV-Protease freigesetzt und durch Gelfiltration auf einer Superdex 200 16/60-Säule vom Maltose-bindenden Protein getrennt. Durch PCR wurden Mutationen in Pneumolysin eingeführt und Proteine wurden wie beim Wildtyp-Toxin exprimiert und gereinigt.

Pneumolysin wurde unter Verwendung der Dampfdiffusionsmethode mit sitzendem Tropfen kristallisiert, indem gleiche Volumina Pneumolysin (10 mg/ml) und 100 mM Tris-Bicine pH 8,5, enthaltend 30 mM CaCl2, 30 mM MgCl2, 20 % v/v Glycerin, 14 % w/v PEG 4K, 6 mM Phosphocholinchlorid bei 4 °C. Domäne 4 wurde in 30 % w/v PEG 2000 MME mit 100 mM Kaliumthiocyanat bei 20 °C kristallisiert. Alle Kristalle wurden in flüssigem Stickstoff gelagert und während der Datenerfassung bei 100 K gehalten. Beugungsdaten wurden an der Diamond Light Source gesammelt und mit Mosflm25 verarbeitet. Phasen für das Volllängenprotein wurden durch molekularen Ersatz mit Phaser26 unter Verwendung der Struktur von Perfringolysin als Suchmodell (PDB: 1M3I) bestimmt. Phasen für die Struktur der Domäne 4 wurden unter Verwendung der Domäne 4 der Pneumolysin-Struktur als Suchmodell bestimmt. Die Modelle wurden mithilfe von Zyklen manueller Verfeinerung mit Coot27 und Verfeinerung in Refmac5, einem Teil der CCP4-Software-Suite28, und in Phenix29 optimiert. Sowohl Wildtyp-Pneumolysin als auch Pneumolysin mit der Doppelsubstitution Asp385Asn und Cys432Ala wurden kristallisiert, aber die Mutante lieferte durchweg Kristalle mit der besten Qualität.

Rote Blutkörperchen von Schafen (1 % v/v; Thermo Scientific) wurden gewaschen, indem 10 ml defibriniertes Schafsblut bei 1734 g bei 4 °C pelletiert und das Zellpellet in gekühlter phosphatgepufferter Kochsalzlösung resuspendiert wurde. Zweifache Reihenverdünnungen von Pneumolysin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung wurden in eine 96-Well-Mikrotiterplatte mit rundem Boden aliquotiert und mit einem gleichen Volumen 1 % v/v Schafblut gemischt. Die Platten wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und intakte rote Blutkörperchen und Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 1734 g und 4 °C pelletiert. Der Überstand wurde in die entsprechenden Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen und flachem Boden überführt und die Absorption jeder Vertiefung bei 410 nm gemessen. Inhibitionstests wurden auf ähnliche Weise durchgeführt, außer dass Cholesterinverdünnungen zu einer festen Menge Pneumolysin (0,626 μM) hinzugefügt wurden. Diese Pneumolysinkonzentration reichte auch bei den Mutanten mit verminderter hämolytischer Aktivität aus, um die Erythrozyten zu lysieren.

Fluoreszenzdaten wurden in einem Fluoromax-4-Instrument (Horiba Jobin Yvon) bei einer Endproteinkonzentration von 1 μM Pneumolysin unter Verwendung einer Quarzfluoreszenzküvette mit geringem Volumen (300 μl) gesammelt. Proteine wurden bei 280 nm mit einer Spaltbreite von 2,5 nm angeregt und Fluoreszenz wurde zwischen 300 und 400 nm in 1-nm-Intervallen mit einer Spaltbreite von 2,5 nm nachgewiesen. Alle Spektren wurden bei 20 °C aufgenommen. Den Proben wurde erlaubt, sich 150 Sekunden lang zu äquilibrieren, bevor die Spektren gesammelt und die Puffer-Leerwerte von allen Datensätzen abgezogen wurden.

Liposomen wurden durch Zugabe von L-α-Phosphatidylcholin (130 μmol; 100 mg) zu Cholesterin (130 μmol; 50 mg) und Dihexadecylphosphat (13 μmol; 7,1 mg) zu 5 ml einer 1:1 Methanol/Chloroform-Mischung erzeugt ein Glasmesskolben (5 ml). Die Mischung wurde durch Rühren solubilisiert und die Flüssigkeit unter einem trockenen Stickstoffstrom auf Eis entfernt. Die Stickstoffzufuhr wurde gestoppt, sobald die gesamte sichtbare Flüssigkeit verdampft war und die Lipide als durchscheinendes gelbes Gel an den Seiten des Kolbens klebten. Die Lipide wurden in 5 ml PBS durch Vortexen und anschließende Ultraschallbehandlung bei Raumtemperatur für 90 Sekunden suspendiert.

Zitierweise für diesen Artikel: Marshall, JE et al. Die Kristallstruktur von Pneumolysin bei einer Auflösung von 2,0 Å enthüllt die molekulare Packung des Präporenkomplexes. Wissenschaft. Rep. 5, 13293; doi: 10.1038/srep13293 (2015).

Walker, JA, Allen, RL, Falmagne, P., Johnson, MK & Boulnois, GJ Molekulare Klonierung, Charakterisierung und vollständige Nukleotidsequenz des Gens für Pneumolysin, das Sulfhydryl-aktivierte Toxin von Streptococcus pneumoniae. Infect Immun 55, 1184–9 (1987).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kadioglu, A., Weiser, JN, Paton, JC & Andrew, PW Die Rolle der Virulenzfaktoren von Streptococcus pneumoniae bei der Besiedlung und Erkrankung der Atemwege des Wirts. Nat Rev Microbiol 6, 288–301 (2008).

Artikel CAS Google Scholar

Marriott, HM, Mitchell, TJ & Dockrell, DH Pneumolysin: ein zweischneidiges Schwert während der Wirt-Pathogen-Interaktion. Curr Mol Med 8, 497–509 (2008).

Artikel CAS Google Scholar

Berry, AM, Ogunniyi, AD, Miller, DC & Paton, JC Vergleichende Virulenz von Streptococcus pneumoniae-Stämmen mit Insertions-Duplikations-, Punkt- und Deletionsmutationen im Pneumolysin-Gen. Infect Immun 67, 981–5 (1999).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Canvin, JR et al. Die Rolle von Pneumolysin und Autolysin bei der Pathologie von Lungenentzündung und Septikämie bei Mäusen, die mit einem Typ-2-Pneumokokken infiziert sind. J Infect Dis 172, 119–23 (1995).

Artikel CAS Google Scholar

Paton, JC, Lock, RA & Hansman, DJ Wirkung der Immunisierung mit Pneumolysin auf die Überlebenszeit von Mäusen, die mit Streptococcus pneumoniae infiziert sind. Infect Immun 40, 548–52 (1983).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tilley, SJ, Orlova, EV, Gilbert, RJ, Andrew, PW & Saibil, HR Strukturelle Grundlagen der Porenbildung durch das Bakterientoxin Pneumolysin. Zelle 121, 247–56 (2005).

Artikel CAS Google Scholar

Alouf, JE Cholesterinbindende zytolytische Proteintoxine. Int J Med Microbiol 290, 351–6 (2000).

Artikel CAS Google Scholar

Gilbert, RJ Porenbildende Toxine. Cell Mol Life Sci 59, 832–44 (2002).

Artikel CAS Google Scholar

Palmer, M. Die Familie der Thiol-aktivierten, cholesterinbindenden Cytolysine. Toxicon 39, 1681–9 (2001).

Artikel CAS Google Scholar

Farrand, AJ, LaChapelle, S., Hotze, EM, Johnson, AE & Tweten, RK Nur zwei Aminosäuren sind für die zytolytische Toxinerkennung von Cholesterin an der Membranoberfläche essentiell. Proc Natl Acad Sci USA 107, 4341–6.

Artikel CAS ADS Google Scholar

Rossjohn, J., Feil, SC, McKinstry, WJ, Tweten, RK & Parker, MW Struktur eines cholesterinbindenden, Thiol-aktivierten Cytolysins und ein Modell seiner Membranform. Zelle 89, 685–92 (1997).

Artikel CAS Google Scholar

Korchev, YE et al. Ein in Pneumolysin konserviertes Tryptophan bestimmt die Eigenschaften von Kanälen, die durch Pneumolysin in Zellen und planaren Lipiddoppelschichten gebildet werden. Biochem J 329, 571–7 (1998).

Artikel CAS Google Scholar

Sekino-Suzuki, N., Nakamura, M., Mitsui, KI & Ohno-Iwashita, Y. Beitrag einzelner Tryptophanreste zur Struktur und Aktivität von Theta-Toxin (Perfringolysin O), einem cholesterinbindenden Cytolysin. Eur J Biochem 241, 941–7 (1996).

Artikel CAS Google Scholar

Leung, C. et al. Schrittweise Visualisierung der Membranporenbildung durch Suilysin, ein bakterielles cholesterinabhängiges Cytolysin. Elife 3, e04247 (2014).

Artikel Google Scholar

Mitchell, TJ, Andrew, PW, Saunders, FK, Smith, AN & Boulnois, GJ Komplementaktivierung und Antikörperbindung durch Pneumolysin über eine Region des Toxins, die homolog zu einem menschlichen Akute-Phase-Protein ist. Mol Microbiol 5, 1883–8 (1991).

Artikel CAS Google Scholar

Saunders, FK, Mitchell, TJ, Walker, JA, Andrew, PW & Boulnois, GJ Pneumolysin, das Thiol-aktivierte Toxin von Streptococcus pneumoniae, benötigt für die In-vitro-Aktivität keine Thiolgruppe. Infect Immun 57, 2547–52 (1989).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Polekhina, G., Giddings, KS, Tweten, RK & Parker, MW Einblicke in die Wirkung der Superfamilie der cholesterinabhängigen Cytolysine aus Studien zu Intermedilysin. Proc Natl Acad Sci USA 102, 600–5 (2005).

Artikel CAS ADS Google Scholar

Johnson, S., Brooks, NJ, Smith, RA, Lea, SM & Bubeck, D. Strukturelle Grundlage für die Erkennung des porenbildenden Toxins Intermedilysin durch den menschlichen Komplementrezeptor CD59. Cell Rep 3, 1369–77 (2013).

Artikel CAS Google Scholar

Koster, S. et al. Die Kristallstruktur von Listeriolysin O enthüllt molekulare Details der Oligomerisierung und Porenbildung. Nat Commun 5, 3690 (2014).

Artikel ADS Google Scholar

Gilbert, RJ et al. Zwei strukturelle Übergänge bei der Membranporenbildung durch Pneumolysin, das porenbildende Toxin von Streptococcus pneumoniae. Cell 97, 647–55 (1999).

Artikel CAS Google Scholar

Gilbert, RJ et al. Selbstinteraktion von Pneumolysin, dem porenbildenden Proteintoxin von Streptococcus pneumoniae. J Mol Biol 284, 1223–37 (1998).

Artikel CAS Google Scholar

Yan, C., Wu, F., Jernigan, RL, Dobbs, D. & Honavar, V. Charakterisierung von Protein-Protein-Schnittstellen. Protein J 27, 59–70 (2008).

Artikel CAS Google Scholar

Shewell, LK et al. Die cholesterinabhängigen Cytolysine Pneumolysin und Streptolysin O erfordern für ihre hämolytische Aktivität die Bindung an Glykane der roten Blutkörperchen. Proc Natl Acad Sci USA 111, E5312–20 (2014).

Artikel CAS Google Scholar

Battye, TG, Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, HR & Leslie, AG iMOSFLM: eine neue grafische Schnittstelle für die Beugungsbildverarbeitung mit MOSFLM. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 67, 271–81 (2011).

Artikel CAS Google Scholar

McCoy, AJ et al. Phaser-Kristallographiesoftware. J Appl Crystallogr 40, 658–674 (2007).

Artikel CAS Google Scholar

Emsley, P. & Cowtan, K. Coot: Modellbauwerkzeuge für molekulare Grafiken. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60, 2126–32 (2004).

Artikel Google Scholar

Collaborative Computational Project, N. Die CCP4 Suite: Programme für die Proteinkristallographie. Acta Cryst. D Biol Crystallogr 50, 760–763 (1994).

Adams, PD et al. PHENIX: ein umfassendes Python-basiertes System zur Lösung makromolekularer Strukturen. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 213–21 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

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Alexandre R. Gingras

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JEM, BHAF, ARG, RL, MdAS, MEM, PCEM, PWA und RW führten die Experimente durch und/oder analysierten/interpretierten die Daten. PCEM, PWA und RW haben die Experimente entwickelt. PWA und RW haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Marshall, J., Faraj, B., Gingras, A. et al. Die Kristallstruktur von Pneumolysin bei einer Auflösung von 2,0 Å enthüllt die molekulare Packung des Präporenkomplexes. Sci Rep 5, 13293 (2015). https://doi.org/10.1038/srep13293

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Eingegangen: 30. März 2015

Angenommen: 16. Juli 2015

Veröffentlicht: 3. September 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep13293

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