Vergleichende Bewertung von p5+14 mit SAP und Peptid p5 durch Dual

Scientific Reports Band 6, Artikelnummer: 22695 (2016) Diesen Artikel zitieren

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Amyloidose ist eine Proteinfehlfaltungsstörung, die durch die extrazelluläre Ablagerung von Amyloid gekennzeichnet ist, einer komplexen Matrix bestehend aus Proteinfibrillen, hypersulfatierten Glykosaminoglykanen und der Serum-Amyloid-P-Komponente (SAP). Die Ansammlung von Amyloid in viszeralen Organen führt zur Zerstörung der Gewebearchitektur, was zu Funktionsstörungen und Versagen der Organe führt. Eine frühzeitige Differenzialdiagnose und Krankheitsüberwachung sind für die Verbesserung der Patientenergebnisse von entscheidender Bedeutung. Daher wäre die Ganzkörper-Amyloid-Bildgebung in dieser Hinsicht von Vorteil. In Europa wird die nicht-invasive molekulare Bildgebung von systemischem Amyloid mithilfe von Jod-123-markiertem SAP durchgeführt; Dieser Tracer ist jedoch in den USA nicht erhältlich. Daher haben wir synthetische, polybasische Peptide mit der Bezeichnung p5 und p5+14 als alternative Radiotracer zum Nachweis systemischer Amyloidose untersucht. Hier führen wir eine vergleichende Wirksamkeitsbewertung des radioaktiv markierten Peptids p5+14 mit p5 und SAP in Amyloid-beladenen Mäusen durch, indem wir Dual-Energy-SPECT-Bildgebung und Gewebebioverteilungsmessungen verwenden. Alle drei Radiotracer banden in vivo selektiv Amyloid; Allerdings war p5+14 in bestimmten Organen deutlich wirksamer als p5. Darüber hinaus band SAP hauptsächlich an hepatosplenales Amyloid, wohingegen p5+14 an zahlreichen amyloidbeladenen anatomischen Stellen, einschließlich Milz, Leber, Bauchspeicheldrüse, Darm und Herz, weit verbreitet war. Diese Daten unterstützen die klinische Validierung von p5+14 als Amyloid-Radiotracer für Patienten in den USA.

Amyloidablagerungen bestehen aus Proteinfibrillen in Verbindung mit hypersulfatierten Glykosaminoglykanen und Serumproteinen wie der Serum-Amyloid-P-Komponente (SAP)1. Die unablässige Ablagerung von extrazellulärem Amyloid führt zur Störung der Gewebearchitektur2,3, zur Zytotoxizität4 und schließlich zu Organfunktionsstörungen und -versagen. Systemische Amyloidose ist eine seltene Krankheit mit jährlich etwa 3.500 neuen Diagnosen in den USA. Bei diesen Patienten kann Amyloid jedes viszerale Gewebe befallen, die Herz- und Nierenbeteiligung ist jedoch mit der höchsten Sterblichkeitsrate verbunden1. Aufgrund ihrer Seltenheit und des heterogenen klinischen Erscheinungsbildes bleibt die frühzeitige und genaue Diagnose systemischer Amyloiderkrankungen eine Herausforderung5. Expertenmeinungen von Ärzten und Forschern legen nahe, dass eine frühzeitige Diagnose entscheidend für die Verbesserung der Patientenergebnisse ist6,7. Die Diagnose von Amyloidose beruht derzeit auf der Untersuchung von mit Kongorot gefärbten Gewebeproben aus Biopsien. Das Vorhandensein von Amyloid führt bei mikroskopischer Betrachtung mit kreuzpolarisierter Beleuchtung zu grüner Doppelbrechung8,9. Diese Technik ist veraltet, bleibt jedoch der diagnostische Standard. Das Färbeverfahren und die Interpretation sind jedoch nicht trivial und Biopsien sind anfällig für Probenahmefehler, die allesamt zu falsch negativen Ergebnissen führen können. Darüber hinaus gibt eine positive Diagnose auf der Grundlage einer Gewebekongophilie keinen Aufschluss über das Ausmaß der Ganzkörper-Amyloidbelastung bei Patienten, und die Entnahme mehrerer Organbiopsien ist nicht praktikabel und kann zur Morbidität beitragen.

Eine vollständige Darstellung der Amyloidbelastung bei Patienten kann die Diagnose bestätigen, die Prognose beeinflussen und die Krankheitsüberwachung unterstützen. Derzeit ist der Goldstandard für die systemische Amyloid-Bildgebung, der routinemäßig nur in Europa verwendet wird, die Gammaszintigraphie mit Jod-123-markiertem SAP als Radiotracer10,11,12. Obwohl diese Technik wirksam ist, ist sie von der FDA nicht für den Einsatz in den USA zugelassen; Daher ist ein alternativer Bildgebungsansatz erforderlich. Darüber hinaus hat es sich für den klinischen Nachweis von Amyloid im Herzen als nicht wirksam erwiesen13,14, ein Organ, das bei mehr als 50 % der Patienten mit Leichtketten-assoziierter (AL) Amyloidose – der häufigsten Form der viszeralen Amyloiderkrankung7 – betroffen ist . Zu diesem Zweck haben wir synthetische, amyloidreaktive, polybasische Peptide entwickelt, die Amyloid bevorzugt über elektrostatische Wechselwirkungen binden4. Diese Peptide wurden verwendet, um menschliche AL- und Transthyretin-assoziierte (ATTR)-Amyloidablagerungen in formalinfixierten Gewebeschnitten in vitro gezielt anzusprechen und anzufärben15,16. Darüber hinaus wurde die Peptidreaktivität mit entzündungsassoziiertem (AA) Amyloid in einem transgenen Mausmodell mithilfe der Einzelphotonen-Emissions-Computertomographie (SPECT) und der Mikroautoradiographie dokumentiert4,16,17,18. Bemerkenswerterweise wurden zwei α-helikale Peptide mit einer Lys-Ala-Gln-Lys-Ala-Gln-Ala-Heptad-Wiederholung, bezeichnet als p5 und p5+14, gut charakterisiert4,15,16,17,18,19,20 ( Abb. 1). Von diesen weist das Peptid p5+14 aufgrund der erhöhten Elektropositivität eine höhere Affinität zu Amyloid auf und hat sich als vielversprechendes Amyloid-Bildgebungsmittel erwiesen18. Pläne zur Bewertung dieses Reagenzes in einer klinischen Bildgebungsstudie der Phase I an Patienten mit AL-Amyloidose sind im Gange.

Physikalische Eigenschaften der amyloidreaktiven Peptide p5 und p5+14 und des Proteins SAP.

(A) Die Primärstruktur der Peptide p5 und p5+14 zeigt die charakteristische Heptad-Wiederholung. Die physikalischen Eigenschaften aller drei Proteine wurden mit der Protparam-Software (http://web.expasy.org/protparam/) berechnet. Sekundärstrukturen von Peptiden wurden mit dem Online-Vorhersageprogramm I-TASSER40 vorhergesagt. Die Röntgenkristallstruktur von SAP wurde bestimmt, PDB# 1SAC. Chromatogramme der HPLC-Reinigung (B) und Massenspektrometriespektren (C) der Peptide p5 und p5+14. Die Massen für die Peptide p5 und p5+14 repräsentieren [M + 3H]+3 bzw. [M + 5H]+5.

Hier berichten wir über eine Reihe vergleichender Wirksamkeitsstudien, die das Peptid p5+14 mit p5 und dem klinischen Standard SAP bei einzelnen Mäusen mit AA-Amyloidose vergleicht, indem wir Dual-Energy-SPECT-Bildgebung und quantitative, Spillover-korrigierte Gewebebioverteilungsmessungen verwenden20. Wir haben in vitro gezeigt, dass das Peptid p5+14 im Vergleich zu p5 stärker an menschliche AL-Amyloidfibrillen bindet und auch eine deutlich stärkere Aufnahme in bestimmte viszerale Organe von AA-Mäusen zeigte. Darüber hinaus war p5+14 im Vergleich zu SAP, das hauptsächlich in Leber und Milz vorkam, an zahlreichen mit AA-Amyloid beladenen anatomischen Stellen lokalisiert, insbesondere in der Bauchspeicheldrüse und im Herzen erkrankter Mäuse.

Beide Peptide wurden als einzelne Spezies durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt und hatten geeignete Massen mit zusätzlichen Protonen [M + 3H]+3 und [M + 5H]+5, wie durch Matrix-unterstützte Laserdesorption/-ionisation bestimmt. Flugmassenspektrometrie (MALDI-TOF) (Abb. 1). Die Peptide und SAP wurden nach der chromatographischen Reinigung leicht mit einer Radioreinheit von >90 % radioaktiv markiert, wie durch SDS-PAGE und Phosphorimaging nachgewiesen wurde. Zunächst verglichen wir die Reaktivität der Peptide p5 und p5+14 hinsichtlich ihrer Fähigkeit, Amyloid in vitro und in vivo zu binden. Wir gingen davon aus, dass die erhöhte Nettoladung von p5+14 (Abb. 1) aufgrund erhöhter elektrostatischer Wechselwirkungen zu einer erhöhten Amyloidreaktivität führen würde. Bindungstests mit 125I-markierten Peptiden, die synthetischen rVλ6Wil- und IAPP-Fibrillen zugesetzt wurden, sowie menschlichem ALκ4-Amyloidextrakt und murinem AA-Leberhomogenat zeigten in jedem Fall einen statistisch signifikanten Anstieg der Bindung von 125I-p5+14 im Vergleich zu 125I -p5 (p < 0,05 unter Verwendung eines ungepaarten t-Tests; Tabelle 1). Die Bindung von p5+14 an murines AA-beladenes Leberhomogenat (p = 0,002) und rVλ6Wil (p = 0,02) war ~15 % höher; Allerdings war die ALκ4-Bindung um 40 % erhöht (p = 0,0006) und die Reaktivität mit IAPP-Fibrillen verdoppelte sich (p = 0,001). Um die relative elektrostatische Avidität jedes Peptids für rVλ6Wil-Fibrillen zu bestimmen, wurden Bindungstests im Milieu zunehmender Ionenstärke durchgeführt (Abb. 2A). Die zur Verringerung der Bindung um 50 % erforderliche NaCl-Konzentration (IC50) betrug 0,5 M für 125I-p5, stieg jedoch auf ~1,2 M für das Peptid 125I-p5+14, was darauf hindeutet, dass die zusätzlichen 4 Lysinreste den Fibrillen eine erhöhte elektrostatische Avidität verliehen hatten ( Abb. 2A).

Vergleich der Reaktivität von Peptid p5 und p5+14-Amyloid in vitro und in vivo.

(A) Bindung von 125I-p5 (graue Kreise) und 125I-p5+14 (schwarze Kreise) an rVλ6Wil-Fibrillen, durch Peptidbindungstest, in Lösungen mit zunehmender Ionenstärke (Mittelwert ± SD; SD war <10 % für alle Punkte). und Fehlerbalken sind nicht sichtbar). Die Daten wurden mithilfe von Prism mit einer Sigmoidgleichung angepasst. (B) Dual-Energy-Gewebebioverteilung von 125I-p5+14 und 99mTc-p5 in AA-Mäusen. Balken stellen den Mittelwert %ID/g (n = 3) mit SD dar. Für jede Maus werden einzelne Datenpunkte angezeigt. Die Daten wurden mithilfe eines unabhängigen t-Tests mit einem Bonferroni-korrigierten α-Wert von 0,01 analysiert, wobei *p < 0,01.

Es wurden Dual-Energy-Gewebebioverteilungsmessungen durchgeführt, um die Reaktivität von 125I-p5 und 99mTc-p5+14 in einzelnen AA-beladenen Mäusen zu vergleichen (Abb. 2B). Die Retention von 99mTc-p5+14 war in der mit Amyloid beladenen Leber und dem Darm signifikant höher (p < 0,01) als die des Peptids 125I-p5 und war in allen anderen untersuchten Organen vergleichbar (Abb. 2B).

Als nächstes verglichen wir das Peptid p5+14 mit dem Goldstandard-Mittel für die klinische Bildgebung, SAP, mithilfe der Dual-Energy-SPECT-Bildgebung. Transgene H2/IL-6-Mäuse wurden durch Injektion einer Suspension extrahierten murinen AA-Amyloids aus der Milz zur Entwicklung einer schweren systemischen AA-Amyloidose induziert. Das Vorhandensein von Amyloid in den Mäusen wurde durch Untersuchung von Gewebeschnitten mit dem amyloidophilen Farbstoff Kongorot bestätigt (Abb. 3). Es wurde gezeigt, dass jede der fünf AA-Amyloidmäuse an einer Amyloiderkrankung litt.

Systemische Verteilung von AA-Amyloid in H2/IL-6-Mäusen.

(A) Mit H&E oder Kongorot gefärbte Gewebeschnitte einer repräsentativen Maus weisen auf das Vorhandensein von schwerem systemischem Amyloid bei AA-Mäusen hin, was durch die blau-goldene Doppelbrechung belegt wird, die auf Amyloid hinweist und in den mit Kongorot gefärbten Schnitten zu sehen ist. (B) Jede der fünf AA-Mäuse hatte schweres AA-Amyloid, was durch das Vorhandensein von kongorot-doppelbrechenden Ablagerungen in einem repräsentativen Gewebe (Milz) nachgewiesen wurde. Originalobjektivvergrößerung 10×.

Die SPECT/CT-Bildgebung von 125I-SAP und 9mTc-p5+14 in AA-Mäusen zeigte organspezifische Unterschiede in der Amyloidaufnahme der beiden Radiotracer (repräsentatives Subjekt in Abb. 4A dargestellt). In 3D-Darstellungen der Bilddaten wurde 99mTc-p5+14 relativ gleichmäßig über die viszeralen Organe verteilt beobachtet. Dies stand im Gegensatz zur Bindung von 125I-SAP, die sich hauptsächlich in einer hepatosplelen Aufnahme manifestierte (Abb. 4A). Zweidimensionale Darstellungen des SPECT/CT-Bildes bestätigten die visuelle Aufnahme von 99mTc-p5+14 in Leber (L), Milz (Sp), Bauchspeicheldrüse (P) und Darm (Int) sowie eine fast ausschließliche Aufnahme von 125I-SAP durch Amyloid in Leber und Milz (Abb. 4A). In diesen Experimenten gab es keine visuellen Hinweise auf die Aufnahme eines der Radiotracer im Herzen, das in diesem Modell bekanntermaßen nur geringe, diffuse Amyloidablagerungen aufweist.

Dual-Energy-SPECT/CT-Bilder von 125I-SAP und 99mTc-p5+14 in repräsentativen AA-Amyloid-beladenen und WT-Mäusen.

Dreidimensionale und 2D-koronale Bilder der Verteilung von 99mTc-p5+14 und 125I-SAP bei einzelnen Mäusen mit AA-Amyloidose (A) und einer gesunden WT-Kontrolle (B). Die Radioaktivität ist falsch rot-blau (3D-Bilder) und rot oder blau für 99mTc-p5+14 bzw. 125I-SAP in den 2D-Bildern. Wo: L, Leber; P: Bauchspeicheldrüse; Sp, Milz; Int, Darm; K, Niere; Deine, Schilddrüse. Zwei zufällig ausgewählte Mäuse aus jedem Satz von fünf AA- und fünf WT-Mäusen wurden abgebildet.

Bei amyloidfreien WT-Tieren (Abb. 4B) wurde Radioaktivität in den Nieren (K) von Mäusen beobachtet, denen 99mTc-p5+14 injiziert wurde, aufgrund der Akkumulation von 99mTc in der Nierenrinde, die mit dem Abbau des Peptids einhergeht. Im Gegensatz dazu wurde Radioiodid in der Schilddrüse (Thy) von Mäusen beobachtet, die 125I-SAP erhielten (Abb. 4B). Dies war auf die Freisetzung von Radiojodid während der Dehalogenierung und des Katabolismus des SAP in der Leber sowie auf die Organisation des freigesetzten Jodids durch die Schilddrüse zurückzuführen. Bemerkenswerterweise gab es keine spezifische Aufnahme eines der beiden Radiotracer in amyloidfreien Organen.

Ein quantitativer Vergleich der Aufnahme von 125I-SAP und 99mTc-p5+14 in amyloidbeladenen Organen wurde durch die Verwendung von Spillover-korrigierten Dual-Energy-Gewebebioverteilungsmessungen erreicht (Abb. 5 und Tabelle 2). Wie durch die SPECT-Bildgebungsdaten vorhergesagt, sammelten sich 99mTc-p5+14 und 125I-SAP in Organen an, die Amyloidablagerungen enthielten – Leber, Bauchspeicheldrüse, Milz und Darm (Abb. 5A; repräsentative einzelne Mäuse). Bei WT-Mäusen wurde jedoch in amyloidfreien Organen keine Retention beobachtet (Abb. 5B).

Dual-Energy-Bioverteilungsdaten für 125I-SAP und 99mTc-p5+14 in zwei AA-Amyloid-beladenen Mäusen und einem repräsentativen WT-Tier.

Bioverteilung des Radiotracers 24 Stunden (SAP; graue Balken) und 4 Stunden (p5+14; schwarze Balken) nach der Injektion bei zwei repräsentativen weiblichen Mäusen mit AA-Amyloidose 5 Wochen nach AEF (A) und einem Mittelwert ± SD von fünf WT-Tiere (B). Die Daten werden als Crossover-korrigierter %ID/g ausgedrückt. Hoch. Int. und tief. Int. repräsentiert den oberen bzw. unteren Darm. (C) Statistische Analyse der Gewebebioverteilungsdaten. Balken stellen den Mittelwert (n = 5) mit SD dar. Für jede Maus werden einzelne Datenpunkte angezeigt (offene Symbole = p5+14; gefüllte Symbole = SAP). Die Daten für Leber, Milz, Darm und Herz wurden mit einem unabhängigen T-Test und die der Bauchspeicheldrüse mit einem Mann-Whitney-U-Test analysiert. Die Signifikanz wurde unter Verwendung eines Bonferroni-korrigierten α-Werts von 0,01 ermittelt, wobei *p < 0,01, **p < 0,001.

Die Aufnahme von 125I-SAP war in der Milz im Vergleich zu 99mTc-p5+14 bei jeder untersuchten Maus etwa viermal höher (p < 0,001). Im Gegensatz dazu wurde 99mTc-p5+14 im Vergleich zu 125I-SAP in deutlich größeren Mengen durch Amyloid in der Bauchspeicheldrüse (p = 0,009) und im Herzen (p < 0,001) zurückgehalten. Bemerkenswerterweise war die Aufnahme von 125I-SAP durch das pankreatische AA-Amyloid bemerkenswert gering (<1 % ID/g), wohingegen die mittlere Aufnahme von 99mTc-p5+14 in diesem Organ 7,6 % ID/g betrug (n = 5 Mäuse). Die Bindung von 99mTc-p5+14 im Herzen war deutlich größer als die von 125I-SAP (p < 0,001); Aufgrund der diffusen und spärlichen Beschaffenheit der Ablagerungen in diesem Organ ist kardiales AA-Amyloid jedoch in SPECT-Bildern schwer zu erkennen. Mit Ausnahme der Leber wurde durch die Pearson-Korrelationsanalyse in den untersuchten Organen keine direkte Korrelation zwischen der Aufnahme von SAP und p5+14 nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass die beiden Radiotracer möglicherweise unabhängige Amyloid-assoziierte Liganden binden (Tabelle 2).

Derzeit gibt es in den USA keine Methoden zur Darstellung der Ganzkörper-Amyloidbelastung bei Patienten mit systemischer Amyloidose. Obwohl sich bestimmte knochensuchende Wirkstoffe und Aβ-Amyloid-Bildgebungs-Tracer als vielversprechend bei der Erkennung kardialer Amyloiderkrankungen erwiesen haben, ist ihr Einsatz begrenzt und es gibt keine Hinweise darauf, dass sie in der Lage sind, Amyloid an allen anatomischen Stellen nachzuweisen21,22,23,24. Angesichts der Heterogenität der Organbeteiligung bei Patienten mit systemischer Amyloidose besteht weiterhin Bedarf an der Entwicklung von Wirkstoffen, die Amyloid an mehreren anatomischen Stellen abbilden können – vorzugsweise mit Pan-Amyloid-Reaktivität. In Europa wird systemisches Amyloid effektiv durch planare Gammaszintigraphie und SPECT unter Verwendung von SAP aus menschlichem Plasma, radioaktiv markiert mit 123I10,11,12, abgebildet. Dieses Reagenz ist von der US-amerikanischen Food and Drug Administration nicht für die Verwendung zugelassen, möglicherweise aufgrund ihrer Anforderungen an strenge antivirale Verfahren für biologische Moleküle menschlichen Ursprungs, die die amyloidophile Aktivität von SAP inaktivieren. Aus diesem Grund haben wir eine Reihe synthetischer, polybasischer Heparin-bindender Peptide mit hoher Affinität und Spezifität für die hypersulfatierten Glykosaminoglykane entwickelt, die allgegenwärtig in Amyloidablagerungen vorkommen4,16,25,26,27. Darüber hinaus interagieren diese Peptide auch direkt mit Amyloidfibrillen, unabhängig vom konstituierenden Protein, aus dem sie gebildet werden15,18. Ziel dieser Studie war es, die Amyloid-Bindungsaktivität der Peptide p5 und p5+14 sowie p5+14 direkt mit dem aktuellen klinischen Standard SAP zu vergleichen.

Das Peptid p5 wurde in einem Screening von sieben natürlich vorkommenden und synthetischen heparinreaktiven Peptiden als spezifisches amyloidreaktives Peptid identifiziert, wie durch SPECT/CT von AA-Amyloidmäusen, Bioverteilungsstudien und Mikroautoradiographie nachgewiesen wurde16. Die Wechselwirkung mit Amyloid wird hauptsächlich durch elektrostatische Wechselwirkungen angetrieben; p5 bindet jedoch nicht die reichlich vorhandenen Heparansulfat-Proteoglykane, die auf der Zelloberfläche und in extrazellulären Matrizen gesunder Gewebe exprimiert werden16. Basierend auf diesen ersten Beobachtungen stellten wir die Hypothese auf, dass Peptide mit erhöhter Neigung zur α-Helizität und mit erhöhter positiver Ladung die beobachteten Peptid-Amyloid-Wechselwirkungen verbessern könnten, die vermutlich von der Peptid-Sekundärstruktur und elektrostatischen Wechselwirkungen abhängen28.

Vor diesem Hintergrund wurde das Peptid p5+14 als erweiterte Variante von p5 mit zusätzlichen vier Lysinresten konstruiert. Dieses Peptid wurde als verstärktes Amyloid-Targeting-Mittel zur Verwendung als molekularer Bildgebungs-Tracer bei Patienten mit systemischer Amyloidose entwickelt18. Es wurde gezeigt, dass das Peptid p5+14 in vitro zahlreiche synthetische Amyloidfibrillen (AL, Aβ und AIAPP) sowie menschliche ALκ- und ALλ-Amyloidextrakte bindet18. Darüber hinaus band p5+14 bei radioaktiver Markierung in einem murinen Mausmodell bevorzugt AA-Amyloid und reichert sich nicht in gesunden, amyloidfreien Geweben an18. Die Übersetzung des p5+14-Peptids als klinisches Bildgebungsmittel für Patienten mit AL und Transthyretin-assoziierter systemischer Amyloidose wird derzeit vom Science Moving towArds Research Translation and Therapy (SMARTT)-Programm am National Heart, Lung and Blood Institute der USA unterstützt NIH.

Die hier präsentierten Daten zeigen, dass das Peptid p5+14 im Vergleich zu p5 eine deutlich erhöhte Reaktivität mit AA-Amyloid in vivo sowie mit AL- und AIAPP-Amyloidfibrillen und -extrakten in vitro aufweist. Die erhöhte elektropositive Ladung führte zu einer stärkeren Bindung an synthetische Fibrillen, was durch die Stabilität der Peptid-Fibrillen-Wechselwirkung im Milieu zunehmender Ionenstärke belegt wird (Abb. 2A). Die erhöhte Amyloid-Reaktivität aufgrund der zunehmenden Ladung trägt wahrscheinlich zur erhöhten Aufnahme und Retention dieses Peptids durch Amyloid in vivo bei. Die positive Nettoladung allein reicht jedoch nicht aus, um die spezifische Reaktivität dieser Peptide mit Amyloid zu erklären, da ähnlich hoch geladene Peptide wie Protamin in vivo keine gleichwertige Spezifität aufweisen16. Rullo et al. zeigten, dass α-helikale Peptide mit in einer Reihe auf einer Seite der Helix angeordneten Lysinresten Heparin wirksamer binden als gleich geladene Peptide mit nichtlinearen Abständen der Lysinreste28. Wir stellten daher die Hypothese auf, dass der erhöhte Lysingehalt mit einer stringenten Heptad-Wiederholung im Kontext einer α-helikalen Sekundärstruktur p5+14 im Vergleich zum Peptid p5 zu einem wirksameren Amyloid-Bindungsmittel machen würde.

Radioiodiertes SAP ist der „Goldstandard“-Radiotracer, der in Europa für die gammaszintigraphische Bildgebung von Amyloid bei Patienten verwendet wird. Um die Wirksamkeit unseres 99mTc-p5+14-Bildgebungsmittels im Vergleich zu 125I-SAP zu validieren, haben wir ihre Amyloidreaktivität mithilfe der Dual-Energy-SPECT-Bildgebung untersucht, einer leistungsstarken Technik zur vergleichenden Bewertung zweier Radiotracer bei einzelnen Tieren. Dies wird durch die Auflösung der nieder- und hochenergetischen Radionuklide in den SPECT-Daten erreicht. Die Dual-Energy-SPECT-Bildgebung umgeht die Variabilität der Amyloidablagerung bei einzelnen Mäusen, da sowohl 125I-SAP als auch 99mTc-p5+14 in dasselbe Subjekt injiziert und untersucht wurden. Die Aufnahme von 125I-SAP erfolgte bei den Mäusen hauptsächlich in der Hepatosplena mit einer deutlich höheren Retention in Milz und Leber im Vergleich zu 99mTc-p5+14. Die molekulare Bindungsstelle von SAP auf Amyloid bleibt rätselhaft, obwohl in vitro gezeigt wurde, dass sie sowohl Heparin29 als auch synthetische Fibrillen30 bindet, ähnlich dem Bindungsprofil des Peptids p5+14. Es ist unwahrscheinlich, dass SAP in unseren Bildgebungsexperimenten mit p5+14 um Amyloid-Bindungsstellen konkurrieren könnte, da von jedem Radiotracer nur Mikrogrammmengen injiziert wurden und die Amyloidbelastung groß ist (wir schätzen etwa 10–20 % der Milzmasse). zur histologischen Färbung von Gewebeschnitten). In diesem Mausmodell deuten die Organaufnahmeprofile darauf hin, dass SAP und p5+14 an unterschiedliche Stellen in Amyloidablagerungen binden (Abb. 4). Eine Erklärung für diese Beobachtung ist, dass der SAP-reaktive Ligand in der Milz reichlich vorhanden und für die Bindung umfassend verfügbar ist – das Gleiche gilt nicht für die p5+14-Amyloid-Bindungsstelle. Alternativ können pharmakokinetische oder andere physikalische Barrieren, auf die SAP nicht stößt, die Zugänglichkeit und Aufnahme von p5+14 in den Amyloidablagerungen der Milz behindern. Obwohl der genaue Mechanismus, der dieser Ungleichheit zugrunde liegt, rätselhaft bleibt, wird die Existenz diskreter Bindungsstellen für SAP und p5+14 auch durch die Feststellung gestützt, dass das pankreatische AA-Amyloid bei diesen Mäusen bevorzugt p5+14 band, aber wenig oder kein SAP beobachtet wurde in dieser Orgel. Dieser Befund steht im Einklang mit früheren Bildgebungsstudien mit SAP in diesem Mausmodell20,31. Es ist interessant zu spekulieren, dass es selbst bei einem einzelnen Patienten mit systemischer Amyloidose gewebespezifische Amyloid-„Phänotypen“ gibt, die möglicherweise mit dem Sulfatierungsmuster der im Amyloid mitabgelagerten Glykosaminoglykane oder mit Unterschieden in der Morphologie der Fibrillen zusammenhängen32 . Unabhängig davon deuten die Bild- und Bioverteilungsdaten darauf hin, dass 99mTc-p5+14 die Organverteilung von Amyloidablagerungen in den AA-Mäusen im Vergleich zu 125I-SAP genauer definiert.

Wir haben zuvor mithilfe der Mikroautoradiographie16,18 die spezifische Aufnahme der synthetischen Peptide p5 und p5+14 in allen Amyloidablagerungen von AA-Mäusen nachgewiesen. In der vorliegenden Studie wurde 99mTc-p5+14 direkt mit p5 verglichen und zeigte eine überlegene Affinität für Amyloid. Im Vergleich zu SAP lieferte das radioaktiv markierte Peptid p5+14 bessere Bilder von Amyloidablagerungen an zahlreichen anatomischen Stellen (Abb. 4). Somit hat das Peptid p5+14 das Potenzial, eine effektive Ganzkörperbildgebung der systemischen Amyloidbelastung zu ermöglichen, die mit der von SAP vergleichbaren und in bestimmten Geweben möglicherweise sogar überlegenen Darstellung vergleichbar ist.

Transgene H2-Ld-huIL-6 Balb/c-Mäuse (H2/IL-6) exprimieren konstitutiv das menschliche IL-6-Transgen, was zu chronischen, schweren Entzündungen und der Überproduktion von Akute-Phase-Reaktanten, wie dem Serum-Amyloid-Protein A, dem Vorläufer, führt Protein der systemischen, entzündungsassoziierten (AA) Amyloidose31,33. Die Amyloidablagerung wurde bei 8 Wochen alten weiblichen Mäusen durch intravenöse Injektion von 100 μg Amyloid-verstärkenden Faktor (AEF – ein unlösliches Präparat aus Amyloidfibrillen, isoliert aus der Milz von Mäusen mit AA-Amyloidose), suspendiert in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) induziert34 . Alle Tierversuche wurden gemäß den vom Animal Care and Use Committee der University of Tennessee genehmigten Protokollen durchgeführt. Die University of Tennessee ist eine von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC-I) akkreditierte Einrichtung.

Menschliches SAP wurde wie zuvor beschrieben aus autopsiebedingten, mit Amyloid beladenen Geweben isoliert20. Kurz gesagt, mit menschlichem Amyloid beladene Milz wurde mit einem Polytron-Homogenisator (Brinkmann Instruments, Westbury, New York) bei Einstellung 6 10 Sekunden lang in tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS)/2 mM CaCl2 bei ~100 mg/ml suspendiert. Das unlösliche Material wurde dann durch 30-minütige Zentrifugation bei 10.000 × g pelletiert und erneut durch Zentrifugation gewaschen. Anschließend wurde die Probe erneut in Gegenwart von TBS/10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) homogenisiert. Nach einer abschließenden Zentrifugation wie oben wurde dem Überstand, der rohes menschliches SAP enthielt, CaCl2 zugesetzt, um eine Endkonzentration von 20 mM zu erreichen, und 2 Stunden lang mit 5 ml O-Phosphoryl-Ethanolamin (PE)-konjugierten Sepharose-Kügelchen (hergestellt von) inkubiert Mischen von 113 mg PE mit 50 ml aktivierter ECH-Sepharose [GE Healthcare] bei pH 4,5 über Nacht) bei Raumtemperatur. Die Perlen wurden dann zweimal mit 100 ml TBS/2 mM CaCl2 gewaschen und das menschliche SAP durch Zugabe von TBS/10 mM EDTA eluiert. Fraktionen, die SAP enthielten, wurden gepoolt und gegen 10 Volumina PBS dialysiert. Die Untersuchung von Coomassie-gefärbten SDS-PAGE-Gelprofilen ergab, dass das Produkt zu >95 % rein war.

Gereinigtes SAP (~100 μg) wurde durch Zugabe von 2 mCi 125I (PerkinElmer, Waltham, MA) in Gegenwart von 10 μg Chloramin T für 2 Minuten radiojodiert35. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 20 μg Natriummetabisulfit gestoppt. Ungebundenes Radioisotop wurde vom Produkt durch Gelfiltrationschromatographie auf Ultragel Aca-34-Harz unter Verwendung von PBS/0,1 % Gelatine als mobile Phase abgetrennt. Fraktionen von etwa 0,5 ml wurden gesammelt und die Radioaktivität in jeder Fraktion durch Gammazählung gemessen – die drei Fraktionen mit den höchsten Zählungen wurden gepoolt.

Die Peptide p5 und p5+14 wurden kommerziell synthetisiert (Keck Laboratories, New Haven, CT) und intern durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer mobilen Phase aus Acetonitril (ACN) und 0,05 % Trifluoressigsäure mit einer Flussrate von 1 ml/ gereinigt. Sek. (2 %/min Anstieg des ACN). Aus der HPLC-Analyse isolierte Proben der Peptide p5 und p5+14 wurden getrocknet und zur Vorbereitung der (+)MALDI-TOF-Analyse in Analytlösungsmittel (30 % ACN, 0,01 % TFA in Wasser) bei ~0,2 mg/ml resuspendiert. α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA) wurde in Matrixlösungsmittel (50 % ACN, 0,3 % TFA in Wasser) bei einer Endkonzentration von 8 mg/ml suspendiert. Vier μl Analytsuspension (Peptid) und 24 μl Matrixlösung wurden gemischt und 1 μl der Mischung auf die MALDI-Platte aufgetragen. Die Massenspektrometrie wurde mit einem Voyager DE-PRO-Massenspektrometer (Applied Biosystems, Boston, MA, USA) durchgeführt. Typischerweise wurden massenspektrometrische Spektren im linearen Modus mit einer Laserleistung von 2390 kW·cm−2 aufgenommen. Alle MALDI-Spektren wurden extern mit bekannten Peptidstandards kalibriert.

Die Peptide wurden im Wesentlichen wie oben beschrieben mit 125I radioaktiv markiert, jedoch durch Gelfiltration unter Verwendung einer Sephadex G-25-Größenausschlussmatrix (PD10; GE Healthcare)16,20 gereinigt. Die Konjugation von Peptiden mit 99mTc wurde wie folgt erreicht. Zu 20 μL 0,15 N NaOH wurden 20 μL (~40 μg) in Wasser gelöstes Peptid und 10 μL 100 μg/ml SnCl2, frisch zubereitet in 0,01 N HCl, gefolgt von 2 mCi 99mTc04− in ~100 μL Kochsalzlösung hinzugefügt ( Cardinal Health, Knoxville, TN). Nach 15 Minuten Reaktionszeit bei RT wurde das Produkt mit einer PD10-Säule wie oben beschrieben36 gereinigt. Die radiochemische Reinheit aller Produkte wurde qualitativ durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt, analysiert durch Phosphor-Bildgebung (Cyclone Storage Phosphor System, PerkinElmer, Shelton, CT).

Vergleichende Dual-Energy-Aufnahmeexperimente wurden an einzelnen AA-Mäusen (5 Wochen nach Amyloid-Induktion mit AEF) und Wildtyp-Mäusen (n = 5 pro Gruppe) durchgeführt. Die gesamte SPECT/CT-Bildgebung wurde mit einer Inveon-Trimodalitäts-SPECT/PET/CT-Plattform37 (Siemens Preclinical, Knoxville, TN) durchgeführt. Bilddaten wurden mit Inveon Acquisition Workplace (IAW) Version erfasst und rekonstruiert. 2,0.

Zum Vergleich von 125I-SAP und 99mTc-p5+14 wurde Mäusen 125I-SAP (45 μCi, 8 μg) verabreicht und 20 Stunden danach 99mTc-p5+14 (110 μCi, 5 μg) verabreicht. Die Mäuse wurden 4 Stunden nach der Injektion von 99mTc-p5+14 eingeschläfert. Die Bilddaten für die Radionuklide mit niedriger und hoher Energie wurden nacheinander durch die Aufnahme von 60 16-sekündigen Projektionen in insgesamt 1,5 Umdrehungen gewonnen. Ein Fünf-Loch-Kollimator (Maus-Ganzkörper) mit einer Apertur von 1 mm Durchmesser wurde 30 mm von der Mitte des Sichtfelds entfernt verwendet. Die Bilddaten im entsprechenden Energiefenster wurden unter Verwendung eines Maximum-A-Priori-Algorithmus (MAP – 16 Iterationen, 6 Teilmengen, β = 1) auf einer Matrix mit x- und y-Dimensionen von 88 und z-Dimensionen von 312 und isotropen Voxeln von 0,5 mm rekonstruiert . Anschließend wurde eine Post-hoc-Schwächungskorrektur auf die rekonstruierten Daten unter Verwendung von CT-Bilddaten angewendet. Die Streukorrektur wurde mithilfe einer SPECT-TEW-Methode (Triple Energy Window)38 durchgeführt.

Für alle Mäuse wurden CT-Daten zur anatomischen Co-Registrierung und Schwächungskorrektur unter Verwendung einer auf 80 kVp vorgespannten Röntgenspannung mit einem Anodenstrom von 500 μA erfasst. Es wurden zwei Bettpositionen mit einer Belichtung von 240 ms verwendet und 361 Projektionen gesammelt, die eine kontinuierliche Rotation von 360° mit geringer Vergrößerung und Binning bei 4 abdeckten. Die Daten wurden unter Verwendung einer Implementierung des Feldkamp-gefilterten Kegelstrahlalgorithmus39 auf einer 256 × 256 × 603-Matrix rekonstruiert mit isotropen 211,4-μm-Voxeln.

Zur histologischen Beurteilung des Vorhandenseins von Amyloid in jeder Maus wurden 6 μm dicke Schnitte aus formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Blöcken geschnitten, die Gewebe von Mäusen enthielten, die radioaktiv markiertes SAP und p5+14 erhalten hatten. Die Gewebeschnitte wurden auf Plus-Objektträger gelegt und mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gegengefärbt. Der Nachweis von Amyloid wurde in aufeinanderfolgenden Gewebeschnitten durch einstündiges Anfärben mit einer alkalischen Kongorotlösung (0,8 % w/v Kongorot, 0,2 % w/v KOH, 80 % Ethanol) bei Raumtemperatur und anschließende Gegenfärbung mit Mayer-Hämatoxylin erreicht 2 Minuten.

Alle Proben wurden mit einem Leica DM500-Lichtmikroskop untersucht, das mit Kreuzpolarisationsfiltern (für Kongorot) ausgestattet war. Digitale mikroskopische Bilder wurden mit einer gekühlten CCD-Kamera (SPOT RT-Slider; Diagnostic Instruments) aufgenommen.

Zum Vergleich der p5+14- und p5-Peptide wurde Mäusen eine Mischung aus 125I-p5+14 (150 μCi, ~3 μg) und 99mTc-p5 (300 μCi, ~8 μg) intravenös in die seitliche Schwanzvene injiziert Die Mäuse wurden 1 Stunde nach der Injektion durch eine Überdosis Isofluran-Anästhetikum eingeschläfert. Zur Messung der Bioverteilung wurden Gewebe bei der Autopsie entnommen. Nach SPECT/CT-Bildgebung wurden auch Organe von Mäusen entnommen, denen 125I-SAP und 99mTc-p5+14 injiziert worden waren. Von jeder Maus wurde eine kleine Gewebemenge in ein austariertes Plastikfläschchen gegeben und gewogen. Die Radioaktivität im Niedrig- und Hochenergiefenster (125I bzw. 99mTc) wurde mit einem automatischen Gammazähler Wizard 3 (1480 Wallac Gamma Counter, Perkin Elmer) gemessen, wobei eine Crossover-Korrektur vom Hoch- zum Niedrigenergiekanal von 4,6 % angewendet wurde manuell. Die Bioverteilungsdaten wurden als Prozentsatz der injizierten Dosis pro Gramm (%ID/g) Gewebe ausgedrückt.

Bindung von 125I-markiertem p5 und p5+14 an synthetische Amyloidfibrillen, die aus rekombinanten λ6-Variablen-Domänen-Proteinen bestehen, die vom Patienten-Wil (rVλ6Wil) und humanen Insel-Amyloid-Polypeptiden sowie humanen Leichtketten-assoziierten (AL) Amyloid-Extrakten und murinen AA-Leberhomogenaten stammen wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt15,18. Kurz gesagt, 25 μl 1 mg/ml Substrat wurden in einem 0,5 ml Mikrofugenröhrchen 5 Minuten lang bei 21.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 200 μl PBS mit 0,05 % Tween-20 (PBST) resuspendiert. Der Suspension wurden zehn Mikroliter einer 1:100-Verdünnung von 125I-markiertem Peptid (~100.000 Zählimpulse pro Minute (CPM); ~5 ng Peptid) zugesetzt. Die Mischung wurde 1 Stunde lang bei RT rotiert. Die Proben wurden dann zweimal 10 Minuten lang bei 15.000 × g zentrifugiert. Überstände und Pellets wurden nach jedem Schritt getrennt und die Radioaktivität in jedem wurde unter Verwendung eines Cobra II-Gammazählers (Perkin Elmer) mit einer 1-minütigen Erfassung gemessen. Bindungstests wurden in PBS oder Lösungen mit zunehmender Ionenstärke (0,15–2 M NaCl) durchgeführt und der Prozentsatz des an pelletiertes Substrat gebundenen 125I-markierten Peptids wurde mithilfe der „Gleichung (1)“ bestimmt:

Schiefe- und Kurtosis-Statistiken wurden verwendet, um die statistische Normalitätsannahme für Vergleiche und Korrelationen zwischen Subjekten zu bewerten. Bei jeder Schiefe- oder Kurtosis-Statistik über einem absoluten Wert von 2,0 wurde eine nichtnormale Verteilung angenommen. Die Annahme der Homogenität der Varianz wurde mit dem Levene-Test zur Varianzgleichheit überprüft. T-Tests unabhängiger Proben wurden verwendet, um die p5+14- und SAP-Retention in mit Amyloid beladenen Organen (Leber, Milz, Bauchspeicheldrüse, Darm und Herz) zu vergleichen. Für die Analysen wurden Mittelwerte und Standardabweichungen angegeben. Wenn eine statistische Annahme verletzt wurde, wurde ein nichtparametrischer Mann-Whitney-U-Test verwendet. Für nichtparametrische Statistiken wurden Mediane und Interquartilbereiche (IQR) angegeben. Pearson-Korrelationen wurden durchgeführt, um Daten zur Gewebebioverteilung (%ID/g) in allen Organen zu vergleichen. Zur Anpassung an mehrere Vergleiche wurde ein Bonferroni-korrigierter Alpha-Wert von 0,01 (Alpha-Wert von 0,05/5 Tests = 0,01) verwendet, um die statistische Signifikanz zu bestimmen, und alle Analysen wurden mit SPSS Version 21 (IBM Corp., Armonk, NY) durchgeführt.

Zitierweise für diesen Artikel: Martin, EB et al. Vergleichende Bewertung von p5+14 mit SAP und Peptid p5 durch Dual-Energy-SPECT-Bildgebung von Mäusen mit AA-Amyloidose. Wissenschaft. Rep. 6, 22695; doi: 10.1038/srep22695 (2016).

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Wir möchten Jim Wesley und Craig Wooliver für ihre Unterstützung bei der Gewebeverarbeitung, Probenvorbereitung und Kongorot-Färbung danken. Wir danken außerdem Helen P. McWilliams-Koeppen für das Korrekturlesen des Manuskripts. Wir danken auch Dr. Shawn Campagna, Hector Castro Gonzalez und Xinyi Lu für ihre Unterstützung bei massenspektrometrischen Analysen. Diese Arbeit wurde durch das PHS-Stipendium R01DK079984 des National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) sowie durch Mittel des Molecular Imaging and Translational Research Program und der Abteilung für Medizin am UTMCK unterstützt.

Medizinische Fakultät, University of Tennessee Graduate School of Medicine, 1924 Alcoa Highway, Knoxville, 37920, TN, USA

Emily B. Martin, Angela Williams, Tina Richey, Stephen J. Kennel und Jonathan S. Wall

Abteilung für Radiologie, University of Tennessee Graduate School of Medicine, 1924 Alcoa Highway, Knoxville, 37920, TN, USA

Alan Stuckey, Stephen J. Kennel und Jonathan S. Wall

Abteilung für Chirurgie, University of Tennessee Graduate School of Medicine, 1924 Alcoa Highway, Knoxville, 37920, TN, USA

R. Eric Heidel

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JSW und SJK haben die Experimente entworfen; JSW, EBM, REH und SJK analysierten die Daten, erstellten die Zahlen und verfassten das Papier; AW, TR, AS und SJK führten die Experimente durch.

JSW und SJK sind Erfinder eines US-Patents (Nr. 8.808.666), das die Verwendung der Peptide p5 und p5+14 als bildgebende Mittel für Amyloidose beschreibt. JSW, SJK, TR, EBM und AS sind gleichberechtigte Eigentümer von Solex LLC, die Rechte an geistigem Eigentum von der University of Tennessee unterlizenziert hat.

Dieses Werk ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe nichts anderes angegeben ist; Wenn das Material nicht unter der Creative-Commons-Lizenz enthalten ist, müssen Benutzer die Erlaubnis des Lizenzinhabers einholen, um das Material zu reproduzieren. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Nachdrucke und Genehmigungen

Martin, E., Williams, A., Richey, T. et al. Vergleichende Bewertung von p5+14 mit SAP und Peptid p5 durch Dual-Energy-SPECT-Bildgebung von Mäusen mit AA-Amyloidose. Sci Rep 6, 22695 (2016). https://doi.org/10.1038/srep22695

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Eingegangen: 23. September 2015

Angenommen: 22. Februar 2016

Veröffentlicht: 3. März 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/srep22695

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