Molekulare Einblicke in die Biogenese von Glykosylphosphatidylinositol-Ankerproteinen

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 2617 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Eukaryontische Zellen sind mit einer Fülle von Glykosylphosphatidylinositol-Ankerproteinen (GPI-APs) beschichtet, die eine entscheidende Rolle bei der Befruchtung, Neurogenese und Immunität spielen. Die Entfernung eines hydrophoben Signalpeptids und die kovalente Bindung von GPI am neuen Carboxylterminus werden durch einen in allen Eukaryoten konservierten endoplasmatischen Retikulummembran-GPI-Transamidasekomplex (GPI-T) katalysiert. Hier berichten wir über die Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM)-Struktur des menschlichen GPI-T mit einer globalen Auflösung von 2,53 Å und zeigen eine äquimolare heteropentamere Anordnung. Die strukturbasierte Mutagenese legt einen Legumin-ähnlichen Mechanismus für die Erkennung und Spaltung von Proproteinsubstraten nahe, und ein endogener GPI in der Struktur definiert einen zusammengesetzten Hohlraum für das Lipidsubstrat. Dieses längliche aktive Zentrum, das von der Membran ausgeht und einen zusätzlichen Raum von ~22 Å in Richtung der katalytischen Dyade überspannt, ist strukturell für beide Substrate geeignet, die ein amphipathisches Muster aufweisen, das dieser Geometrie entspricht. Unsere Arbeit stellt einen wichtigen Schritt zum mechanistischen Verständnis der GPI-AP-Biosynthese dar.

Die GPI-Verankerung stellt eine allgegenwärtige, metabolisch teure posttranslationale Modifikation eukaryontischer Zelloberflächenproteine ​​dar1,2,3,4,5. GPI-Lipide wurden in den 1980er Jahren strukturell aufgeklärt6 und sind bioaktiv7 und chemisch vielfältig mit einem minimalen Rückgrat, das aus einer Phosphatidylinositolgruppe besteht, die an einen Polysaccharidkern α-Man3-(1 → 2)-α-Man2-(1 → 6)-α-Man1 gebunden ist -(1 → 4)-α-GlcN (Man1/2/3, die drei Mannosen; GlcN, Glucosamin; Zahlen in Klammern geben die Kohlenstoffnummerierung an) (Abb. 1a, ergänzende Abb. 1a). Der Glykankern im reifen GPI trägt zusätzliche funktionelle Gruppen, von denen einige art- und gewebespezifisch sind. Am Reifungsprozess sind mehrere Enzyme beteiligt, darunter Mannosyltransferasen und Phosphorylethanolamin (EtNP)-Transferasen (ergänzende Abbildung 1b)2,3,4. Das EtNP an C2 von Man1 ist eine Voraussetzung für die enzymatische Addition von Man38,9. Anschließend werden in Schritt zwei EtNPs nacheinander auf C6 von Man3 (als Linker für die GPI-Verankerung) und Man2 (für effizientes endoplasmatisches Retikulum (ER)-Golgi) übertragen Transport einiger GPI-APs)2. Die Mannosylierung von Man3 an C2 ist für die GPI-Verankerung in einigen Arten wie Hefen10 essentiell. Bei einigen Trypanosoma-Arten können C3 von Man2 und C3/C4 von Man1 weitere Sacchariddekorationen aufweisen und C6 von GlcN ist mit einem Aminoethylphosphonat modifiziert (zusammengefasst in Lit. 11) (Ergänzende Abbildung 1a). In Bezug auf den Phosphatidylinositol-Teil ist vor der GPI-Verankerung normalerweise eine Acylkette an C2 von Inosit vorhanden (ergänzende Abbildung 1a), wird jedoch in den meisten Fällen (außer bei Erythrozyten) unmittelbar nach der GPI-Anbindung entfernt3. Schließlich wird auch die Fettkette der Phosphatidylgruppe sowohl vor (ergänzende Abbildung 1b) als auch nach dem GPI-Anbindungsschritt umgestaltet, was zu Acyldiversität wie Diacylglycerin, Alkylacylglycerin oder Ceramiden mit unterschiedlicher Länge und Ungesättigtheit führt 2,3,4,11 .

Ein GPI-T ersetzt das C-terminale Signalpeptid (CSP) von Proproteinen durch GPI am ω-Rest (blau) durch eine Transaminierungsreaktion. Im gestrichelten Kasten sind verschiedene Teile gekennzeichnet. EtNP, Ethanolaminphosphat; Mann, Mannose; Ino, Inosit; GlcNH2, Glucosamin. Die Präferenzen für die ω-, ω+1-, ω+2- und ω+3-Stellen sind im gestrichelten Kasten angegeben, wobei die Aminosäure mit einzelnen Buchstaben abgekürzt ist. Die graue Schattierung zeigt die Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER). b GPI-T zeigt einen nahezu Gaußschen Peak bei der Gelfiltration und alle fünf Untereinheiten sind auf einer SDS-PAGE (Einschub) vorhanden, sichtbar gemacht durch In-Gel-Fluoreszenz (links) und Coomassie-Färbung (rechts). Vo und Vt (Dreieck) geben den Hohlraum bzw. das Gesamtvolumen an. Hintergrundabsorptionssignale vor Vo werden nicht vollständig angezeigt. G/T/S/K/U bezieht sich auf die Untereinheiten GPAA1/PIGT/PIGS/PIGK/PIGU. Die Position jeder Untereinheit wurde separat durch Vergleich des Komplexes mit einfach exprimierten Untereinheiten bestimmt. Ein Sternchen weist auf eine geringfügige Verunreinigung hin. Die Molekulargewichte der Proteinmarker sind rechts angegeben. Dargestellt ist ein repräsentatives Ergebnis von drei unabhängigen Experimenten. Unbeschnittene Bilder werden in den Quelldaten bereitgestellt. c Kryo-EM-Karte (i-iii) und Normalansicht der Transmembrandomäne aus ER-Lumen (iv) oder Zytosol (v). Die Zahlen in iv und v geben TMHs an und G/T/U/S/K beziehen sich auf GPAA1 bzw. PIGT/U/S/K. Lipide und Detergenzien werden als Stäbchen (grau) dargestellt. Untereinheiten und zugehörige Kryo-EM-Dichten sind wie angegeben farblich gekennzeichnet.

Diese komplizierten Verankerungen platzieren GPI-APs in Lipidflößen und verleihen ihnen einzigartige regulatorische Eigenschaften in Entwicklungs- und physiologischen Prozessen2,3,4,5. Zu den bemerkenswerten GPI-APs gehören LY6K/TEX101 als Schlüsselfaktoren für die Befruchtung und Biomarker für Unfruchtbarkeit12, Glypicane/Gas1/RECK, die die Hedgehog/Wnt/Notch-Signalisierung modulieren13,14, CD55/CD59, die die Komplementkaskade in der angeborenen Immunität hemmen15, und alkalische Phosphatase als führendes Signal Biomarker für Lebererkrankungen und Krebs16 und Folatrezeptor 1, der die Folataufnahme vermittelt und ein wichtiger Krebsbiomarker ist17. Eine Störung der GPI-AP-Biosynthese führt bei Tieren zur embryonalen Letalität18, während sein Biogeneseweg in Trypanosoma brucei ein validiertes Angriffsziel für Medikamente gegen die tödliche Schlafkrankheit ist19.

Der festgelegte Schritt in der GPI-AP-Biogenese wird durch die GPI-Transamidase (GPI-T) katalysiert, die das C-terminale Signalpeptid (CSP) des Vorläuferproteins spaltet und die EtNP-Einheit des reifen GPI (typischerweise in Form von) kovalent verknüpft vom GPI-Kern mit drei EtNPs und drei Acylketten, Abb. 1a) bis zum neu freigelegten Carboxylterminus des sogenannten ω-Rests (Abb. 1a)1,2,20. Die ω-Stelle ist kein spezifischer Rest, sondern weist eine kleine Stellenkette wie Glycin, Alanin, Serin, Cystein, Aspartat und Asparagin auf. Dem CSP fehlt ebenfalls ein Sequenzkonsens, sondern es enthält vielmehr ein Muster mit einem C-terminalen hydrophoben Schwanz (15–20 Reste), der über einen hydrophilen Spacer (8–12 Reste) mit einer kleinen Seitenkette an der ω+2-Position mit der ω-Stelle verbunden ist (Abb. 1a). GPI-T besteht aus mindestens fünf Untereinheiten (ergänzende Abbildung 1c), nämlich PIGK/Gpi8p, PIGT/Gpi16p, PIGU/Gab1p, PIGS/Gpi17p, GPAA1/Gaa1p in Mensch/Hefe (ergänzende Abbildung 2)2. Zur Vereinfachung der Beschreibung verwenden wir im Folgenden die menschliche Nomenklatur. Es wurde vorgeschlagen, dass PIGK und GPAA1 die Peptidspaltungs-21,22 und GPI-Additionsreaktionen23 durchführen. Es wurde vermutet, dass PIGU und GPAA1 GPI20,24 binden. PIGT-Disulfid verbindet sich bei einigen Arten mit PIGK25 und kann eine strukturelle Rolle spielen. Die Funktion von PIGS ist weniger klar, obwohl sie für die GPI-T-Aktivität26 essentiell ist. Es wird vorhergesagt, dass alle Untereinheiten mindestens eine Transmembranhelix (TMH) enthalten, mit Ausnahme von PIGK bei einigen Arten wie T. brucei27. Eine abweichende Aktivität von GPI-T wurde kürzlich mit mehreren Pathologien in Verbindung gebracht28,29,30,31,32,33,34,35,36,37 wie neurologische Entwicklungsstörungen mit Hypotonie und Kleinhirnatrophie, mit oder ohne Anfälle (NEDHCAS) und Krebs . Es liegen keine experimentellen Strukturinformationen vor, um verschiedene und manchmal widersprüchliche Modelle für den Aufbau26,38,39, die Membrantopologie24,40 und die Untereinheitsfunktion20,21,22,23,24 von GPI-T zu erklären und zu klären.

Hier bestimmen wir eine globale Kryo-EM-Struktur der menschlichen Glycosylphosphatidylinositol-Transamidase (GPI-T) mit einer Auflösung von 2,53 Å und offenbaren eine äquimolare heteropentamere Architektur. Strukturvergleich und Mutagenese legen einen legumainähnlichen Mechanismus für die Peptidspaltung nahe. Die katalytische Stelle ist ca. 22 Å von der Membranschnittstelle entfernt positioniert, eine charakteristische Geometrie, die möglicherweise Spezifität sowohl für das Proprotein als auch für die GPI-Substrate verleiht. Die Dichte eines GPI-Moleküls in einem gemeinsamen Hohlraum und rationale Mutagenese definieren ein verlängertes aktives Zentrum, das sich von der Membran bis zur katalytischen Dyade erstreckt. Unsere Arbeit stellt einen wichtigen Schritt zum mechanistischen Verständnis der GPI-AP-Biosynthese und der mit GPI-T-Mutationen verbundenen Pathophysiologie dar.

Um Einblicke in den GPI-Verankerungsprozess zu gewinnen, haben wir uns vorgenommen, seine 3D-Struktur zu bestimmen, indem wir mit seiner rekombinanten Expression beginnen. Die menschlichen GPI-T-Untereinheiten wurden in HEK293-Zellen mit einem thermostabilen grünen Fluoreszenzprotein (TGP)41-Tag an den C-Termini koexprimiert, um den Reinigungsprozess zu erleichtern. Der Membranproteinkomplex wurde im Detergens Laurylmaltoseneopentylglykol (LMNG) solubilisiert und dann auf einer Strep-Affinitätssäule über PIGU in Digitonin umgewandelt. Eine zweite Affinitätschromatographie über den Nonahistidin-Tag auf PIGT wurde durchgeführt, um die Reinigung freier Untereinheiten zu minimieren. Der Komplex wurde durch Gelpermeationschromatographie weiter fraktioniert. Die Peakfraktionen enthielten alle fünf Untereinheiten zusammen mit geringfügigen Verunreinigungen mit hohem Molekulargewicht, basierend auf den Ergebnissen der In-Gel-Fluoreszenz und der Coomassie-Färbung (Abb. 1b).

Mithilfe der Einzelpartikel-Kryo-EM haben wir die Struktur des Transamidase-Komplexes mit einer nominalen Auflösung von 2, 53 Å bestimmt (Ergänzungsabbildung 3a – c, Ergänzungstabelle 1). Die hochwertige Karte (ergänzende Abbildung 3d) reichte für die Modellerstellung von Anfang an aus und enthielt insgesamt 2.393 Reste (94,4 % Vollständigkeit), 3 N-Glykosylierungsstellen, 4 Disulfidbindungen und 22 Lipid-/Detergensmoleküle.

In Übereinstimmung mit den Fluoreszenzergebnissen im Gel enthielt die komplexe Struktur fünf Untereinheiten mit einer Stöchiometrie von 1:1. Die gesamte GPI-T-Architektur nimmt die Form eines Kanons (die luminale Domäne, hauptsächlich von PIGT/GPAA1/PIGS/PIGK) auf einem Schlitten (die Transmembrandomäne, TMD, hauptsächlich von GPAA1/PIGU) mit einer ungefähren Abmessung von 148 Å an um 141 Å um 83 Å (Abb. 1c). Das aus 24 TMHs bestehende TMD ist aufgeteilt in eine kleine Einheit mit acht TMHs von GPAA1 und eine große Einheit mit einem TMH-Kern (TMH1-12 von PIGU), umgeben von vier Satelliten-TMHs, zwei von PIGS und je eines von PIGT und PIGK. Abgesehen von direkten Kontakten werden die TMH-Wechselwirkungen zwischen den Untereinheiten durch Lipide, einschließlich des zugesetzten Cholesterylhemisuccinats und der mitgereinigten Phospholipide in beiden Membranblättern, weiter verstärkt (Abb. 1c).

Im Transamidierungsprozess spaltet GPI-T das Proprotein am ω-Rest für die GPI-Anbindung. Es wird allgemein angenommen, dass diese Peptidspaltung von der PIGK-Untereinheit durchgeführt wird, einer Cysteinprotease der C13-Familie, zu deren Mitgliedern Hülsenfrüchte und Caspasen gehören21,22. Tatsächlich weist die Proteasedomäne von PIGK eine bescheidene Sequenzhomologie (28,5 % Identität, 46,4 % Ähnlichkeit) (ergänzende Abbildung 4a) und eine hohe strukturelle Homologie mit Leguminen (Cα-RMSD von 2,3 Å) (ergänzende Abbildung 4b – e)42 auf. mit einem zentralen 6-strängigen β-Faltblatt mit 3 α-Helices auf beiden Seiten (Ergänzende Abbildungen 4b, d, e). Darüber hinaus sind Elemente, die für die Proteaseaktivität von Leguminen essentiell sind, einschließlich der katalytischen Dyade, des dreiwertigen Oxyanionlochs und der Reste in den Substratbindungstaschen S1/S1′/S2′, größtenteils konserviert und überlagerbar (Abb. 2a, ergänzende Abb. 4d, e) zwischen den beiden.

a Cartoon (Weizen, α-Helix; Cyan, β-Strang, i) und Oberflächendarstellung (ii) der PIGK-Proteasedomäne mit der katalytischen Dyade (Magenta), S1 (grün), S1′ (gelb) und S2′ (rosa) Rückstände werden als Stäbchen dargestellt (i) oder farblich hervorgehoben (ii). S1/S1′/S2′-Stellen werden von Legumainstrukturen überlagert44. b Funktionstest der Mutanten des aktiven Zentrums. Die scheinbare Aktivität (% des Wildtyps, WT) wurde durch Immunfärbung eines Reporter-GPI-AP (CD59) auf der Oberfläche von PIGK-KO-Zellen gemessen, die mit den angegebenen Mutanten der katalytischen Dyade und S1/S1′/S2′ transfiziert waren. Rückstände (farbcodiert, um denen in a zu entsprechen). Zellen, die PIGK exprimieren, fusioniert mit einem thermostabilen grün fluoreszierenden Protein41, wurden kontrolliert und die Oberflächenfärbung von CD59 wurde durch Durchflusszytometrie weiter analysiert. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten dar. Quelldaten werden bereitgestellt.

Um die funktionelle Bedeutung der strukturellen Ähnlichkeit am aktiven Zentrum zu ermitteln, verwendeten wir einen zellbasierten GPI-AP-Reportertest24, um die scheinbare Aktivität der Mutanten zu untersuchen. In diesem Assay wurde die Oberflächenpräsentation des Reporters CD59 durch Durchflusszytometrie in GPI-T-Knockout-HEK293-Zellen bei ektopischer Expression von Mutanten überwacht. Als Kontrolle führten Mutationen der zuvor identifizierten katalytischen Dyade21 (H164A oder C206S) zur Abschaffung der GPI-T-Aktivität (Abb. 2b).

Die Mutagenese identifizierte kritische Reste im aktiven Zentrum und legte deren möglichen Beitrag nahe. Der Ersatz von R60 an der S1-Stelle durch Glutamat verringerte die GPI-T-Aktivität nahezu (9,8 % im Vergleich zum Wildtyp (WT) und dasselbe im Folgenden), und R60A, R60L oder sogar die konservative R60K-Mutation reduzierten die Aktivität um 20–60 %. (Abb. 2b, ergänzende Abb. 5a), was darauf hindeutet, dass sowohl die Form als auch die positive Ladung von R60 für die Integrität von S1 wichtig waren. Die negative Ladung auf D204 oder D247 war nicht wesentlich (D204N, 94,2 %; D247N, 98,2 %), aber eine Ladungsumkehr war schädlich (D204K, 37,3 %; D247K, 3,2 %). Im Gegensatz dazu tolerierte H61 die Mutation zu Alanin oder sogar Aspartat (H61A, 98,5 %; H61D, 98,7 %) (Abb. 2b), was auf eine weniger wichtige Rolle schließen lässt. Die Mutageneseergebnisse zeigen auch die funktionelle Bedeutung von drei Resten in der entsprechenden S1′- (G165A, 64,5 %; Q207E, 81,2 %, Q207K, 71,2 %) und S2′-Stelle (T179A, 66,7 %) (Abb. 2b)43,44 . Zusammengenommen könnte PIGK einen ähnlichen Mechanismus wie Legumaine für die Peptidspaltung und sogar die Substraterkennung nutzen.

Es wurde vorgeschlagen, dass die GPI-Bindung an den exponierten ω-Rest durch GPI-T gleichzeitig mit dem Peptidspaltungsschritt erfolgt45, was darauf hindeutet, dass die GPI-Bindungsstelle in der Nähe der katalytischen PIGK-Dyade liegt. Dieses Lipidsubstrat trägt drei Acylketten (Abb. 1a) und dürfte aufgrund der ungefähren Länge der Glykane zwischen dem reaktiven EtNP3 und der Phosphatidylgruppe innerhalb von ~25 Å von der katalytischen Dyade in der Membran verwurzelt sein (ergänzende Abb. 1a). ). Interessanterweise wurden Dichten, die zu einem fast vollständigen GPI-Kern (palmitoyliertes Phosphatidylinositol, Glucosylamin und EtNP-modifiziertes Man1) passen (Abb. 3a), in einem Hohlraum beobachtet, der gemeinsam von TMH11/12 von PIGU, TMH2 von GPAA1 und dem einzigen TMH von gebildet wurde PIGT (Abb. 3b) direkt „unter“ der katalytischen Dyade. Obwohl die genaue Ausrichtung der EtNP1-Einheit bei der aktuellen Auflösung nicht eindeutig ist, ist die Dichte für die charakteristische Triacylkette, den Inositol-Glucosylamin-Mannose-Glykankern, gut aufgelöst.

Im Membranhohlraum „unter“ der katalytischen Dyade wurde eine Kryo-EM-Dichte beobachtet, die einen nahezu vollständigen GPI ausfüllt. b Erweiterte Ansicht der zusammengesetzten Stelle, die von den angegebenen TMHs von GPAA1 (G) /PIGU (U) /PIGT (T) /PIGS (S) umfasst wird. Evolutionär konservierte Rückstände (Ergänzende Abb. 6c, d) in der Nähe sind marinefarben (PIGT) und blau (PIGK). Untereinheiten werden als Oberflächen dargestellt, mit der Ausnahme, dass PIGK zusätzlich als Banddarstellungen dargestellt wurde, wobei die katalytische Dyade und die S1/S1′/S2′-Reste in den angegebenen Farben hervorgehoben sind. c Interaktion zwischen dem partiellen GPI (grün) und dem GPI-T (farbcodiert wie angegeben). Abstände (Å) werden entweder durch Zahlen für H-Brücken-Wechselwirkungen angegeben oder für hydrophobe Wechselwirkungen weggelassen (innerhalb von 5 Å des GPI). Eine vertikale Linie markiert die Membrangrenze. Obwohl die Hauptform der Phosphatidyleinheit in Säugetierzellen 1-Alkyl-2-acylglycerin enthält, wurde auf Grundlage der Dichte ein Diacylglycerin modelliert. d Offensichtliche Aktivität von GPI-T-Mutanten im Vergleich zum Wildtyp (WT). GPI-T-KO-Zellen wurden durch TGP-Fluoreszenz41 auf die Expression der Untereinheiten untersucht und mittels Durchflusszytometrie auf Oberflächenfärbung des Reporter-GPI-AP (CD59) analysiert. Das Balkendiagramm ist farbcodiert, um der Farbgebung der Untereinheiten in (b) zu entsprechen. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten dar. Quelldaten werden bereitgestellt.

Die gemeinsame Reinigung des endogenen GPI-Liganden lässt darauf schließen, dass er relativ fest an den Komplex bindet. Tatsächlich haftet der GPI-Kern in unserem Modell über ein reichhaltiges Netzwerk von Wechselwirkungen an der Kavität. Insbesondere kleben die Acylketten hauptsächlich an der Transmembranregion von PIGU, und die Kopfgruppe bildet Wasserstoffbrückenbindungen mit PIGT N461/D521/S523 und PIGU N383/N385 (Abb. 3c).

Interessanterweise ist dieser zusammengesetzte Hohlraum zusätzlich mit einer Dichte gefüllt, die gut zu einem Digitoninmolekül passt, das auch eine Polysaccharidkette wie GPI enthält (ergänzende Abbildung 6a). Darüber hinaus begrenzen mehrere evolutionär konservierte Reste (PIGK F55/D174/S175, PIGT Y456/D459/P460/N461/D521/F522/S523/M524/N527) (ergänzende Abb. 6b, c) einen oberflächenexponierten Fleck, der sich von dort aus erstreckt Membranschnittstelle zur katalytischen Dyade (Abb. 3b). Bemerkenswert ist, dass dieses Motiv reich an sauren/aromatischen Resten ist, die in der Lage sind, H-Bindungen/„fettige Folien“ zu bilden, die häufig bei Protein-Zucker-Wechselwirkungen vorkommen46. Topologisch gesehen ist der Hohlraum so ausgerichtet, dass er in ein Proproteinsubstrat mit dem hydrophoben Teil von CSP in der Membran passt, während der hydrophile Teil den Raum von ~22 Å überspannen würde, um das aktive Zentrum zu erreichen (Abb. 3b). Die zusammengesetzte Natur der GPI-Bindungsstelle wurde zwar durch genetische und biochemische Charakterisierungen in früheren Studien nicht erkannt, steht jedoch im Einklang mit den Erkenntnissen aus solchen Studien, dass alle GPI-T-Untereinheiten für die GPI-Verankerung essentiell sind20,22,26,47.

Um den Hohlraum weiter zu charakterisieren, haben wir 30 Mutanten erzeugt, die auf 10 Reste im konservierten Patch und das an der GPI-Bindung beteiligte Wasserstoffbrückennetzwerk abzielen. Drei Reste, zwei von PIGT und einer von GPAA1, reagierten deutlich auf Mutagenese. D521 bildete zwei H-Bindungen mit GPI (Abb. 3c). Konsequenterweise verringerte der Ersatz durch ein Alanin die scheinbare Aktivität auf 28,9 %, und die Einführung beabsichtigter sterischer Zusammenstöße durch ein Leucin verringerte die Aktivität auf 18,8 %. Die H-Bindung von PIGT S523 war scheinbar nicht essentiell (S523A, 98,4 %), aber die Mutation zu sperrigen Resten verringerte die scheinbare Aktivität (S523F, 76,5 %; S523W, 76,8 %) (Abb. 3d), vermutlich aufgrund sterischer Hinderung. Darüber hinaus brachte eine Doppelmutante (D521L/S523F) die Aktivität nahezu zum Erliegen (6,2 %, Abb. 3d). GPAA1 H354/Q355 liegt innerhalb von 4,5 Å von der EtNP1-Gruppe von GPI. Obwohl die Alaninmutation von H354 die scheinbare Aktivität nicht veränderte, verringerte die Substitution mit Phenylalanin, das ein ähnliches Volumen wie Histidin hat, die Aktivität um etwa 25 % (Abb. 3d). Das Fehlen einer wesentlichen Änderung der GPI-T-Aktivität für einzelne Mutanten anderer Reste (ergänzende Abbildung 6d) könnte durch die Häufigkeit schwacher multivalenter Wechselwirkungen mit GPI erklärt werden.

Es wurde vermutet, dass PIGT aufgrund seiner stabilisierenden Wirkung auf andere Untereinheiten in Zellen eine Gerüstrolle spielt26. Unsere Struktur zeigt konsistent, dass PIGT und PIGU eine Plattform für komplexe Montagen bilden (Abb. 4a). Einerseits packen sich zwei PIGT-Lappen (LbT1 und LbT2) im ER-Lumen zusammen, um eine Struktur zu bilden, die für eine Gerüstfunktion geeignet ist. Konkret stapeln sich zehn verdrillte antiparallele β-Stränge von LbT1 zu einem „Halbrippen“-Käfig, der mit Schleifen und kurzen α-Helices für die Interaktion mit GPAA1/PIGK/PIGS dekoriert wurde, und LbT2 nimmt eine stabile β-Sandwich-Topologie für die Interaktion mit an GPAA1 und PIGU (Abb. 4b). Infolgedessen wurden 25,9 % seiner Gesamtoberfläche von anderen Untereinheiten begraben (Abb. 4a). Andererseits rekrutiert PIGU andere Untereinheiten in der ER-Membran durch eine optimale Geometrie, die die Interaktionsflächen innerhalb der Membran und an der Lumenoberfläche maximiert. Insbesondere sind seine 12-TMHs in zwei zentralen Ringen angeordnet (Abb. 4a, c). Der äußere Ring interagiert mit den Transmembrandomänen aller anderen vier Untereinheiten entlang der Membranebene. Der innere Ring enthält jedoch sechs kurze TMHs, die die Membran nicht vollständig durchqueren, wodurch ein hydrophober Hohlraum entsteht, der die fünf amphipathischen Helices (AH1-5) strategisch anzieht (Abb. 4c). Diese AHs legen wiederum mehrere saure Reste und Dipolmomente frei (Abb. 4c), um eine insgesamt negativ geladene Oberfläche für die elektrostatische Komplementierung mit der entsprechenden PIGT-Oberfläche zu erzeugen (Abb. 4d). Somit ist PIGU optimal als Andockbasis für PIGT und zusammen mit PIGT als Stütze für alle anderen Untereinheiten geeignet.

ein PIGT (Oberflächendarstellungen, blau) und PIGU (Zylinder, gelb/orange) bilden eine Andockplattform für andere Untereinheiten (GPAA1, rot; PIGS, lila; PIGK, cyan, Band). Interaktionsflächen auf PIGT sind schattiert, um der Farbe von GPAA1/PIGK/PIGS zu entsprechen. b PIGT zeigt Skelettmerkmale an. Seine luminale Domäne enthält zwei Lappen (LbT1/2). LbT1 (marin) besteht aus einem zentralen „Brustkorb“-β-Faltblatt (rote Kurve, β1-10), das zwischen Verbindungsschleifen, α-Helices (α1-4) und β-Strängen (β7a, 7b, 8a und) eingebettet ist 10 A). LbT2 (hellblau) besteht aus zwei Schichten von β-Faltblättern mit insgesamt 9 β-Strängen (β1′-9′). Kugeln zeigen Reste an, die mit GPAA1 (rot), PIGK (cyan), PIGS (lila) und PIGU (orange) interagieren. c Seitenansicht (i) und Normalansicht (ii) von PIGU. PIGU verfügt über eine Membrankernregion (orange) mit kurzen Transmembranhelices (TMHs), die von einem Ring aus TMHs (blassgelb) umgeben sind. Diese Anordnung erzeugt einen Membranhohlraum (blaues Trapez), um die fünf amphipathischen Helixe (AH) 1-5 (gelb) aufzunehmen. Die TMHs und AHs sind so angeordnet, dass die C-terminalen Enden mehrerer α-Helices (mit schwarzem Text markiert) zur Oberfläche freiliegen (ii). Die resultierenden Dipolmomente (δ-) und sauren Rückstände (Stabdarstellung, grün) machen die Oberfläche elektrostatisch negativ. d „Offenes Buch“-Darstellung der molekularen Oberfläche des elektrostatischen Potentials (rot, negativ; blau, positiv; weiß, neutral), generiert mit dem Adaptive Poisson-Boltzmann Solver-Modul in PyMOL (Version 2.3.3).

GPI-T ist ein etwas promiskuitives Enzym. Es erkennt keine bestimmte Peptidsequenz. Vielmehr verarbeitet es Substrate mit einem kleinen ω-Rest (A/C/D/G/N/S), gefolgt von einem hydrophilen Spacer aus 8–12 Resten (~24–36 Å in der erweiterten Form) und einem hydrophoben C- Endschwanz (Abb. 1a). Obwohl diese Eigenschaften nicht sehr streng sind, stellen sie ein Muster dar, das von GPI-T scheinbar auf Substratspezifität durch die Positionierung der katalytischen PIGK-Untereinheit untersucht wird.

Im Einzelnen wird die Position von PIGK durch multivalente Schnittstellen hauptsächlich durch Interaktionen mit PIGT und PIGS gesichert. Die PIGK-Proteasedomäne sitzt genau in einem dreiseitigen Hohlraum, der durch die PIGT/PIGU-Plattform sowie GPAA1 und PIGS gebildet wird, die sich aus entgegengesetzten Richtungen nähern (Abb. 1c). Darüber hinaus nutzt PIGK zwei Rillen auf den kleeblattartigen PIGS für Wechselwirkungen, wobei die kugelförmige Lumendomäne die konkave Oberfläche von Groove1 ergänzt und ihre „gürtelartige“ Schleife sich mit der Groove2 verschlingt (Abb. 5a). Diese Konfiguration verbirgt eine Gesamtoberfläche von 2341,9 Å2 und hält PIGK über 18 Wasserstoffbrückenbindungen, 6 Salzbrücken und mehrere hydrophobe Wechselwirkungen fest (Abb. 5b). Darüber hinaus wandert der C-terminale Teil von PIGK entlang einer flachen Oberfläche der Rückseite von PIGT nach unten und knickt seine terminale Helix in die Membran ein, um mit TMH5/7 von PIGU zu interagieren (Abb. 1c, 4a). Schließlich nagelt eine Disulfidbindung zwischen den Untereinheiten zwischen PIGK C92 und PIGT C182, über die zuvor berichtet und in dieser Studie visualisiert wurde, PIGK an PIGT fest (Abb. 5c, d). Im Einklang mit der multivalenten Natur der Wechselwirkungen verursachte die Unterbrechung der Disulfidbindung durch PIGK C92A einen signifikanten (~40 %), aber keinen vollständigen Verlust der scheinbaren GPI-T-Aktivität (Abb. 5e). Durch diese Wechselwirkungen befindet sich PIGK in einer Position „in der Luft“ (relativ zum „Boden“ der Membran), wobei seine katalytische Dyade etwa 22 Å von der Membran entfernt ist (Abb. 5c). Da der Abstand ungefähr dem hydrophilen „Stamm“ von GPI- und Proprotein-Substraten entspricht, die vermutlich in der Membran verwurzelt sind (Abb. 1a), kann diese topologische Anordnung Substratspezifität verleihen.

Ein PIGS (Oberfläche, rosa) hält PIGK (Band), indem es die Proteasedomäne mithilfe einer der Kleeblattrillen umschließt und die Schleifenregion in einer anderen Rille beherbergt. Die vergrabene Oberfläche ist cyanfarben. b Detaillierte Interaktionen zwischen PIGK und PIGS bei Groove 1 (i) und Groove 2 (ii). PIGK-Reste (Cyan) sind mit grauem Text gekennzeichnet und PIGS-Reste (hellviolett) sind mit schwarzem Text gekennzeichnet. Gestrichelte Linien (gelb) zeigen Abstände innerhalb von 3,6 Å. c Eine Disulfidbindung zwischen Untereinheiten (PIGT C182 / PIGK C92) (Magenta) nagelt PIGK (Cyan) an das PIGT (Blau) (oben). Diese und die anderen Wechselwirkungen fixieren PIGK in einer Position, in der sich die katalytische Dyade (roter Punkt) etwa 22 Å „über“ der Membrangrenzfläche befindet (graue Schattierung). Diese Geometrie würde sich für Wechselwirkungen mit GPI eignen, von dem erwartet wird, dass es über die Phosphatidyleinheit mit ihren hydrophilen Glykanketten (ca. 25 Å in der verlängerten Form) aus der Membran in die Membran eindringt, um auf die katalytische Dyade zu treffen. Die Kryo-EM-Dichte für die Disulfidbindung ist grau dargestellt. Eine wie angegeben farbcodierte GPI-T-Struktur (unten) zeigt die ungefähre Position der Disulfidbindung. d Überprüfung der PIGK-PIGT-Disulfidbindung. Die SDS-PAGE-In-Gel-Fluoreszenz zeigt eine Bande mit hohem Molekulargewicht (PIGK-PIGT) in Abwesenheit, aber nicht in Anwesenheit des Reduktionsmittels β-Mercaptoethanol (β-ME) auf Kosten des einzelnen PIGT /PIGK-Bänder. Freie PIGT/PIGK-Banden unter nicht reduzierenden Bedingungen stammten aufgrund des ungleichmäßigen Expressionsniveaus aller fünf Untereinheiten wahrscheinlich von nichtkomplexierten PIGT/PIGK-Proteinen. Andere Untereinheiten wurden ebenfalls co-transfiziert, waren jedoch aufgrund des Fehlens des TGP-Tags41 unsichtbar. Theoretische Molekulargewichte selbst hergestellter fluoreszierender molekularer Marker69 sind rechts angegeben. Dargestellt ist ein repräsentatives Ergebnis von drei unabhängigen Experimenten. Das unbeschnittene Bild ist in der Quelldatendatei verfügbar. e Die Unterbrechung der PIGT-PIGK-Disulfidbindung durch PIGK C92A führt zum Verlust der GPI-T-Aktivität. PIGK-Knockout-Zellen, die TGP-markierten Wildtyp (schwarz), C92A (rot) oder ein Kontrollmembranprotein (grau) exprimierten, wurden durch TGP-Fluoreszenz (für die Expression von PIGK) gesteuert und die Subpopulation wurde auf Oberflächenfärbung analysiert des Reporters GPI-AP (CD59) mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung von Phycoerythrin (PE)-konjugierten Antikörpern. C92A zeigte eine scheinbare Aktivität von 61,0 ± 6,3 % (Sem, n = 3) im Vergleich zum Wildtyp-PIGK. Eine vertikale Linie zeigt den Schwellenwert für die CD59-Fluoreszenz an. Dargestellt ist ein repräsentatives Ergebnis aus drei unabhängigen Experimenten. Quelldaten werden bereitgestellt.

GPAA1 ist die erste GPI-T-Untereinheit, die entdeckt wurde47, ihre funktionelle Rolle ist jedoch weiterhin umstritten. Bioinformatische Studien23,48 haben eine Proteasefaltung und damit eine katalytische Rolle nahegelegt. In unserer Struktur nimmt GPAA1 eine Portikusform mit acht TMHs, vier AHs und einer löslichen Domäne an (Abb. 6a). Während die Transmembrandomäne keine erkennbare strukturelle Homologie mit bekannten Faltungen aufweist, ist die lösliche Domäne tatsächlich ähnlich angeordnet wie die Zn2+-Protease AM-149 (PDB ID 2EK8 https://doi.org/10.2210/pdb2EK8/pdb, Cα RMSD von 3,2). Å) (Abb. 6b). Eine genauere Betrachtung zeigt jedoch, dass der entsprechenden GPAA1-Domäne ein charakteristisches katalytisches Zink-Bindungsmotiv fehlt, das aus Glutamaten, Aspartaten und Histidinen besteht (Abb. 6c) und Mutationen möglicher Zn-Bindungsmotiv-Kandidaten in der Nähe (D153A, E186A, H187A, D188A, E226A, H303A) (Abb. 6d) hatten keinen merklichen Einfluss auf die GPI-T-Aktivität in Zellen (Abb. 6e). Diese Ergebnisse legen nahe, dass GPAA1, selbst wenn es an der Katalyse beteiligt ist, möglicherweise keinen Mechanismus der homologen Zn2+-Proteasen nutzt.

eine Seitenansicht (i) und eine normale (ii) Ansicht von GPAA1. Die Zahlen geben Transmembranhelices (TMHs) an und AH1-3 kennzeichnen die drei amphipathischen Helices (AH). Die lösliche Domäne ist rosa gefärbt und die membranassoziierte Domäne ist regenbogenfarben (blau, N-terminal; rot, C-terminal). b Die lösliche Domäne von GPAA1 (rot/rosa, Zylinder) ähnelt strukturell einer Zn-Protease AM-1 (Cyan, Cartoon, PDB ID 2EK8 https://doi.org/10.2210/pdb2EK8/pdb) mit einem Z- Score von 20,6 und Cα RMSD von 3,2 Å (aus einer DALI-Suche)49. c Die Zn-Bindungsstelle von AM-1 (erweiterte Ansicht der eingerahmten Region in b) besteht aus jeweils zwei Aspartat-, Glutamat- und Histidinresten, die in GPAA1 nicht vollständig konserviert sind (in Klammern). d Anordnung der GPAA1-Aspartat/Glutamat/Histidin (D/E/H)-Reste in der Region, die der Zn-Bindungsstelle in AM-1 entspricht. Trotz der gleichen Zusammensetzung ist es unwahrscheinlich, dass diese Reste eine Zn-Bindungsstelle bilden, da die räumliche Anordnung unterschiedlich ist, insbesondere bei den beiden Histidinresten (grauer Text). e Die Mutation der D/E/H-Reste in (d) verringerte die CD59-Färbung im Durchflusszytometrie-Assay nicht. Die Funktion von Wildtyp-GPAA1 und Mutanten wurde anhand der Oberflächenexpression des GPI-AP-Reporters (CD59) in GPAA1-Knockout-Zellen beurteilt, die mit geeigneten Plasmiden transfiziert waren. Die Zellen wurden durch TGP-Fluoreszenz41 auf GPAA1-Expression untersucht und unter Verwendung von Phycoerythrin (PE)-konjugierten Antikörpern auf CD59-Färbung analysiert. Die gepunktete Linie (grau) zeigt den Hintergrund der CD59-Färbung von Zellen an, die ein nicht verwandtes TGP-markiertes Membranprotein exprimieren (Negativkontrolle). Durchgezogene Linien zeigen die Färbung von Zellen an, die mit Wildtyp-Genen (schwarz) oder mutierten Genen (rot) transfiziert sind. Eine vertikale gestrichelte Linie markiert den anhand der Negativkontrolle ermittelten Schwellenwert (CD59-Gating). Dargestellt ist ein repräsentatives Ergebnis aus drei unabhängigen Experimenten. Daten für alle drei Experimente sind in der Quelldatendatei enthalten.

Ebenso faltet sich ein Teil von PIGS (Resi. 222–398) ähnlich wie eine Protease vom Metzincin-Typ AmzA (Cα RMSD von 3,6 Å)50 (ergänzende Abbildung 7a). Im Gegensatz zu AmzA fehlen PIGS jedoch Elemente für ein aktives Zentrum von Metzincin, das ein konserviertes Methionin in der Nähe eines zinkbindenden Tri-Histidin-Motivs enthält. Darüber hinaus war ein Zinkfinger auf Cysteinbasis in AmzA in PIGS von der Zusammensetzung her unmöglich (ergänzende Abbildung 7b, c). Daher gehen wir davon aus, dass die Protease-ähnlichen GPAA1- und PIGS-Untereinheiten dabei helfen könnten, Proteinsubstrate zu rekrutieren, anstatt eine Spaltung durchzuführen, was an die γ-Sekretase erinnert51.

Die unverzichtbare Rolle von GPI-T bei der GPI-AP-Biogenese wird dadurch hervorgehoben, dass eine Fehlfunktion von GPI-T durch genetische Mutationen zu einer verminderten Oberflächenexpression und neurologischen Entwicklungsstörungen wie NEDHCAS führt28,29,30,31,32,33,34,35,36,37 . Unsere Struktur bietet einen Rahmen, um mögliche Mechanismen für die Pathophysiologie solcher Mutationen vorzuschlagen. Somit zeigte die Kartierung dieser Mutationen auf GPI-T ein Muster bei über der Hälfte von ihnen (12 von 22, PIGK S53F/L86P/A87V/D88N/Y106S/A184V/M246K/C275R, PIGT V528M, GPAA1 S51L/A389P und PIGU). N383K) gruppieren sich in der Nähe der katalytischen Dyade und der GPI-Bindungsstelle (Abb. 7, ergänzende Abb. 8a). Von den übrigen zehn Mutationen befinden sich acht an den Schnittstellen zwischen Untereinheiten (PIGT T183P/E184K/G360V/G366W/R488W, PIGS E308G, GPAA1 W176S und PIGU I70K) (Abb. 7, ergänzende Abb. 8b) und Daher kann die Integrität des Komplexes gestört werden. PIGS L34P kommt in der ersten Transmembranhelix vor und kann durch Verzerrung der Hauptkette zu Faltungsproblemen führen. PIGK Y160S und GPAA1 W176S können auch eine Fehlfaltung fördern, indem sie den kleinen hydrophilen Serinrest in eine hydrophobe Mikroumgebung einführen (ergänzende Abbildung 8c, d).

Kartierung der Krankheitsmutationen (Cα-Kugeln, farbkodiert durch die Kategorien im grauen Kasten) auf die menschliche GPI-T-Struktur (Hauptkette, farbkodierte Zylinderdarstellungen; katalytische Dyade, magentafarbene Stabdarstellungen; GPI, grüne Stabdarstellungen). Zu den Mutationen gehören PIGK S53F/L86P/A87V/D88N/Y160S/A184V/M246K/C275R, die ein neurologisches Entwicklungssyndrom mit Hypotonie, Kleinhirnatrophie und Epilepsie verursachen28, PIGT T183P, das ein geistiges Behinderungssyndrom verursacht31, und PIGT E184K/G360V/R448W im Zusammenhang mit dem Multiplen Anomalien-Hypotonie-Anfalls-Syndrom 332, 35, 36, PIGT E237Q/V528M, das Entwicklungsstörungen verursacht, die Lernbehinderung, Epilepsie, Mikrozephalie, angeborene Fehlbildungen und leichte dysmorphe Merkmale kennzeichnen33, PIGT G366W, das bei Patienten mit epileptischer Apnoe auftritt und multiple angeborene Anomalien, schwere geistige Behinderung und Anfälle34, PIGS L34P/E308G, die mit einem neurologischen Syndrom verbunden sind, das von fetaler Akinesie bis hin zu epileptischer Enzephalopathie reicht30, PIGU I70K/N383K, die bei Patienten mit schwerer geistiger Behinderung, Epilepsie und Gehirnanomalien auftreten29, und GPAA1 S51L/W176S/A389P, die ebenfalls mit Entwicklungsstörungen wie globaler Entwicklungsverzögerung, Epilepsie, Kleinhirnatrophie und Osteopenie in Zusammenhang stehen37. Links: Übersicht mit einem Kästchen, das den Bereich in der Nähe des aktiven Standorts anzeigt. Rechts: die erweiterte Ansicht des umrahmten Bereichs links.

Als Schlüsselenzym, das den bestimmten Schritt im GPI-AP-Biogeneseweg katalysiert, wurde GPI-T ausführlich untersucht und es wurde lange nach einer 3D-Struktur für das mechanistische Verständnis seines Aufbaus und seiner Katalyse gesucht. In dieser Studie berichten wir über die Struktur des menschlichen GPI-T-Komplexes mit einem endogenen GPI-Molekül mit einer Auflösung von 2,53 Å. Kombiniert mit rationaler Mutagenese offenbart die Struktur eine unerwartete zusammengesetzte GPI-Bindungsstelle, innerhalb derer ein Juxta-Membran-Teil von PIGT am meisten zu den Wechselwirkungen beiträgt. Die Mutagenese identifizierte auch kritische Reste in der Nähe der katalytischen Dyade als potenzielle Determinanten für die Proprotein-Substratbindung mit einem ähnlichen Mechanismus wie Leguminen. Die Strukturanalyse legt einen Zusammenbaumechanismus nahe, bei dem GPI-T das Hydrophobie-/Hydrophiliemuster der Substrate auf Spezifität untersucht, und zwar anhand einer Geometrie, bei der der Abstand zwischen der katalytischen Dyade und der Membranschnittstelle als molekulares Lineal zum Filtern von Proprotein- und GPI-Substraten fungiert.

Obwohl die Substratbindungs- und Katalysemechanismen noch durch Strukturstudien von GPI-T mit dem Peptidsubstrat aufgeklärt werden müssen, bietet der Strukturvergleich mit Leguminen mechanistische Implikationen. Es wird angenommen, dass in Hülsenfrüchten die dreiwertige Oxyaniontasche44 (Rückgrat-Amidstickstoff von C189, G149 und Nδ1 des katalytischen Rests H148) den Carbonylsauerstoff des P1-Rests im Substrat polarisiert. Dies erhöht die Elektrophilie des Carbonylkohlenstoffs und ermöglicht die Deprotonierung des katalytischen C189-Sγ und den Start des nukleophilen Angriffs, der zur Peptidspaltung führt. In PIGK sind die entsprechenden PIGK-Reste die ähnlich positionierten C206, G165 und H164 (ergänzende Abbildung 4d, e), was auf eine Analogie im Carbonylaktivierungsprozess hinweist. In Hülsenfrüchten und Caspasen wird die Selektivität des Substrat-P1-Rests hauptsächlich durch die S1-Tasche verliehen, und es wird angenommen, dass die charakteristische zwitterionische S1-Stelle (zwei positiv geladene Reste und zwei negativ geladene Reste) von Hülsenfrüchten für ihre Asparaginspezifität geeignet ist. Dementsprechend sind Hülsenfrüchte nicht in der Lage, Substrate mit einem Aspartat zu verarbeiten, es sei denn, es werden Bedingungen mit niedrigem pH-Wert verwendet, um den P1-Rest zu protonieren44. Obwohl die entsprechende Stelle in PIGK in der Lage ist, Substrate mit verschiedenen ω-Resten (analog zu P1), einschließlich Aspartat, zu verarbeiten, hat sie interessanterweise praktisch die gleiche Zusammensetzung wie S1 von Hülsenfrüchten, abgesehen von einer konservativen Änderung (PIGK D204 gegenüber Hülsenfrucht E187) (Abb . 2a, ergänzende Abb. 4e). Ob und wie diese Stelle Proproteinsubstraten Selektivität verleiht, muss noch strukturell und biochemisch untersucht werden.

Zusätzlich zur Proteaseaktivität ist für die GPI-Verankerung eine Ligationsreaktion zur Konjugation des GPI-Peptidamids, vermutlich ebenfalls durch PIGK, erforderlich. In Hülsenfrüchten52 beruht die Ligaseaktivität auf einem kürzlich entdeckten Mechanismus, bei dem ein aus D147 umgewandelter Succinimidrest Energie liefert. Trotz seiner allgemeinen Ähnlichkeit mit Legumainen enthält PIGK ein Glycin (G163) als Gegenstück zum Legumain D147 (ergänzende Abbildung 4a), wodurch die Succinimid-vermittelte Ligation bei PIGK weniger wahrscheinlich ist. Stattdessen nutzt PIGK möglicherweise einen Ping-Pong-Mechanismus ähnlich dem der Sortase-Transamidierung53: Die katalytische Dyade wirkt auf das Proprotein und bildet ein halbstabiles Thioacyl-Zwischenprodukt, das den ω-Rest und C206 verbindet. Die ankommende Amingruppe auf EtNP3 greift dann dieses Zwischenprodukt an, produziert GPI-AP und setzt PIGK frei.

Aufgrund seiner ähnlichen Anordnung der Sekundärstrukturelemente wie Zinkproteasen wurde bereits früher vorgeschlagen, dass es sich bei GPAA1 um eine katalytische Untereinheit handelt23. Wir überprüfen die strukturelle Ähnlichkeit, stellen jedoch klar, dass GPAA1 das Zn-Bindungsmotiv fehlt (Abb. 6b – e). Darüber hinaus möchten wir darauf hinweisen, dass die Region, die der AM-1-Zn-Bindungsstelle entspricht, von der katalytischen Dyade in unserer Struktur entfernt ist (~ 50 Å) (ergänzende Abbildung 9a).

Es wurde vorgeschlagen, dass sowohl GPAA1 als auch PIGU an der GPI-Bindung beteiligt sind. Der funktionelle Teil wurde auf das letzte TMH für GPAA124 eingegrenzt, das von den übrigen GPAA1-TMHs umhüllt wird (Abb. 6a). Da diese Stelle ca. 20 Å von der zusammengesetzten GPI-Bindungsstelle entfernt ist (ergänzende Abbildung 9a), ist derzeit unklar, wie GPAA1 TMH8 an der GPI-Bindung beteiligt ist. In ähnlicher Weise wird angenommen, dass die Reste F274/W275, die sich im AH5 von PIGU befinden (ergänzende Abbildungen 2c, 9b), für die GPI-Bindung von entscheidender Bedeutung sind. Obwohl die funktionelle Bedeutung der beiden Reste in dieser Studie bestätigt wird (ergänzende Abbildung 9c), liegen sie auch distal (~ 10 Å) zur zusammengesetzten GPI-Bindungsstelle (ergänzende Abbildung 9b). Mutationen in diesen Regionen können die GPI-Bindung durch allosterische Effekte beeinträchtigen.

Die Dichte eines GPI-Moleküls in der Struktur liefert wertvolle Informationen für einen Überblick über das aktive Zentrum, der detaillierte Mechanismus, beispielsweise die Notwendigkeit von EtNP3 für die GPI-T-Reaktion, bleibt jedoch unbekannt, da es über Man1 hinaus keine verlässliche Dichte gibt . Zusätzlich zur Verbesserung der Auflösung sollte die Entwicklung von Mutanten zum kovalenten Einfangen von GPI oder GPI-APs im aktiven Zentrum dazu beitragen, das vollständige Bild der Substratbindung aufzudecken.

Das glycanhaltige Digitoninmolekül in der Nähe der zusammengesetzten GPI-Bindungsstelle kann funktionelle Auswirkungen haben. Da Lipide meist zweidimensional in der Membranebene diffundieren, nutzt GPI-T den Hohlraum möglicherweise als „Hamstertasche“, um GPI zu stopfen. Auf diese Weise kann die relativ geringe Diffusionsrate von Lipiden durch die lokal hohe Konzentration von Substraten in einer Reaktion ausgeglichen werden.

Die Interpretation der scheinbaren Aktivität aus dem GPI-AP-Reporter-Assay ist diskussionswürdig. Assays für Wildtyp und Mutanten sollten idealerweise unter Bedingungen durchgeführt werden, bei denen die Aktivität aus Gründen der Normalisierung linear mit der Enzymbelastung reagiert. Bei zellbasierten Tests, bei denen die Konzentrationen von Enzymen und Substraten weniger kontrollierbar sind, könnte die tatsächliche Aktivität entweder über- oder unterschätzt werden. Eine Überschätzung kann auftreten, wenn die Expression einer Mutante höher ist als die des Wildtyps. Allerdings ist diese Einschränkung für ein komplexes Enzym weniger problematisch als für einkomponentige Enzyme. Im Gegensatz zu Einzelkomponentenenzymen würde die Überexpression einzelner Untereinheiten auf der endogenen Hintergrundebene anderer Untereinheiten die funktionelle Konzentration des Komplexes nicht erhöhen (es sei denn, die Untereinheit erhöht die Ebene anderer Untereinheiten aus Gründen der Transkriptions-/Translationsregulation oder aus Stabilitätsgründen). Daher sollte die Änderung der scheinbaren Aktivität der interessierenden Mutation zugeschrieben werden, mit Ausnahme von Mutationen, die den Komplexaufbau beeinträchtigen. In diesem Fall könnten die Defekte aufgrund der möglichen konzentrationsabhängigen Förderung der Komplexbildung unterbewertet werden. Andererseits kann es zu einer Unterschätzung kommen, wenn die Expression einer Mutante geringer ist als die des Wildtyps. Es stimmt zwar, dass nicht alle Mutanten in gleichem Ausmaß exprimiert wurden und dieses Szenario daher weiterhin möglich ist. Wir stellen jedoch fest, dass die Färbung des GPI-AP-Reporters nur für die TGP-positiven Zellen gezählt wurde (als Hinweis auf die Expression der Untereinheit). von Interesse). Obwohl einige TGP-positive Signale möglicherweise auf freies TGP durch Abbau zurückzuführen sind, führt ein abgespaltenes C-terminales TGP nicht unbedingt zu einer abgebauten und nicht funktionsfähigen Untereinheit. Darüber hinaus stellten wir fest, dass die Abbaugrade gering waren und gemäß den In-Gel-Fluoreszenzergebnissen zwischen Wildtyp und Mutanten für bestimmte Untereinheiten vergleichbar waren (ergänzende Abbildung 10). Abschließend sollten wir beachten, dass die Gründe für den Funktionsverlust von Mutanten für die PIGK- und GPI-Bindungsstellen als kritisch für die Substratbindung interpretiert wurden, es besteht jedoch die Möglichkeit, dass sie die Aktivität beeinträchtigen, indem sie die Wechselwirkungen zwischen Untereinheiten beeinflussen, insbesondere für diejenigen am gemeinsamen Hohlraum.

GPI-T ist ein evolutionär konserviertes Enzym und basierend auf nativen PAGE-Ergebnissen wurde berichtet, dass das Hefe-Homolog in Dimer vorliegt54. Obwohl wir in dieser Studie keine Dimerpartikel für das menschliche GPI-T beobachtet haben, nehmen wir zur Kenntnis, dass in der Literatur eine zunehmende Anzahl waschmittelspezifischer schwacher Oligomere von Membranproteinen berichtet wird55,56,57,58. Ob GPI-T als aktuelles Heteropentamer oder als Dimer höherer Ordnung fungiert, muss in Zukunft untersucht werden. Solche Studien, und in der Tat Enzymkinetikstudien, würden von einem robusten biochemischen Test im Reagenzglas mit authentischen Substraten, der noch entwickelt werden muss, großen Nutzen bringen. Aus dem gleichen Grund muss noch untersucht werden, ob unsere Methode der GPI-T-Reinigung ihre enzymatische Aktivität bewahrt. Die Tatsache, dass der Komplex bei der Gelfiltration einen Gaußschen Peak zeigte, die Fähigkeit des Enzyms, einen endogenen GPI-Liganden an seinem aktiven Zentrum nach langwierigen Solubilisierungs-/Detergensaustausch-/Chromatographieschritten einzufangen, und die Konsistenz zwischen der Strukturbeobachtung und früheren biochemischen Kenntnissen von Der Komplex legt die funktionale Relevanz unserer Struktur nahe.

Während der Einreichung unseres Manuskripts haben Zhang et al. veröffentlichten die Struktur des im Glyco-Diosgenin-Detergens solubilisierten GPI-T mit einer Auflösung von 3,10 Å (PDB ID 7W72 https://doi.org/10.2210/pdb7W72/pdb)59 mit konsistenten Ergebnissen, die in dieser Arbeit berichtet wurden. Die beiden Strukturen sind mit einem Cα RMSD von 0,997 Å insgesamt sehr ähnlich. Im Vergleich zu 7W72, das nur ein Phospholipid (GPI) identifizierte, ermöglicht die höher aufgelöste Karte aus dieser Arbeit die Visualisierung von 22 Lipid-/Detergensmolekülen (Abb. 1c) und mehr Details des GPI-Liganden sowohl in der Acylkette als auch im Glykankern (Ergänzende Abbildung 11). Das 7W72-Modell ist etwas kompakter aufgebaut und die katalytische Dyade liegt etwa 3 Å näher am Lipidsubstrat (ergänzende Abbildung 11). Die funktionale Bedeutung der Unterschiede muss noch untersucht werden. Möglicherweise repräsentieren die beiden Strukturen während des Katalysezyklus unterschiedliche Konformationszustände wie Substratbindung und Produktfreisetzung. Alternativ muss der Abstand zwischen der katalytischen Dyade und der Membranschnittstelle eine gewisse Flexibilität aufweisen, um Proproteinsubstrate mit unterschiedlichen Längen in der Spacer-Region des CSP aufzunehmen (Abb. 1a).

Zusammenfassend formuliert unsere Arbeit praktikable Arbeitsmodelle für den GPI-Verankerungsprozess und bietet einen hochauflösenden Rahmen, der die Gestaltung biochemischer und biophysikalischer Experimente zur detaillierten Untersuchung katalytischer Mechanismen inspiriert.

Die Gene, die für die menschlichen GPI-T-Untereinheiten GPAA1 (Genbank-ID NP_003792.1), PIGK (NP_005473.1), PIGS (NP_149975.1) und PIGT (NP_057021.2) kodieren, wurden aus cDNA-Klonen, die von den Autoren bereitgestellt wurden, PCR-amplifiziert. Institut. Das Gen, das für das menschliche PIGU (NP_536724.1) kodiert, wurde mittels PCR unter Verwendung überlappender Oligonukleotide amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden von Gibson in verschiedenen Versionen des pBTSG41-Vektors zusammengesetzt60, die so modifiziert wurden, dass sie die folgenden Tag-Sequenzen am 3′-Ende der kodierenden Sequenz des thermostabilen Fluoreszenzproteins (TGP)41-Tags trugen: GPAA1, 2×Flag; PIGK, Hämagglutinin (HA); SCHWEINE, Myc; PIGT, 9×His; PIGU, Strep. Für die Disulfidvernetzung zwischen PIGT und PIGK wurde das für TGP kodierende DNA-Fragment in den Konstrukten GPAA1/PIGS/PIGU entfernt, um Hintergrund in der In-Gel-Fluoreszenz zu vermeiden. Die Konstrukte wurden durch DNA-Sequenzierung verifiziert.

Mutationen wurden mittels standardmäßiger PCR-basierter ortsgerichteter Mutagenese hergestellt. DNA-Sequenzen wurden durch Sanger-Sequenzierung verifiziert.

Die TGP-Tags befinden sich auf der Zytosolseite des GPI-T, gegenüber seiner großen luminalen Domäne. Die Durchflusszytometrie (unten) zeigte, dass das TGP-markierte GPI-T funktionsfähig war, da die Co-Transfektion aller fünf TGP-markierten Untereinheiten in einer Zelllinie, bei der alle GPI-T-Untereinheiten gestört waren (siehe unten), die Zelloberflächenexpression des GPI wiederherstellte -AP-Reporter CD59.

Um Zelllinien mit defekten einzelnen Untereinheiten zu erzeugen, wurden die endogenen Gene, die für die fünf GPI-T-Untereinheiten kodieren, separat durch CRISPR-Cas9-Bearbeitung unter Verwendung von zwei oder drei Paaren von sgRNA-Oligos, die mithilfe des Online-Servers (http://cistrome.org) entworfen wurden, unterbrochen /SSC/)61 mit den folgenden Sequenzen (Vorwärts-/Rückwärtspaare):

5′- CACCGTGTGGGGCTGCTGCTGGCAC-3′/5′- AAACGTGCCAGCAGCAG CCCCACAC-3′ und 5′- CACCGCAGGAGCAAGAAGCCGACAG-3′/5′- AAAC CTGTCGGCTTCTTGCTCCTGC-3′ für GPAA1; 5′- CACCGAATTACCAACATA GAACTCG -3′/5′- AAACCGAGTTCTATGTTGGTAATTC -3′, 5′- CACCGTTC ATATTAGTTTGGCTAGC -3′/ 5′- AAACGCTAGCCAAACTAATATGAAC -3′ und 5′- CACCGGCTCTAGCTAGTAGTCAAGT -3′/5′- AAACACTTGACTACTAGCT AGAGCC -3′ für PIGK; 5′- CACCGTGAGCCTCAGGAACAAGCGG -3′/5′- AAA CCCGCTTGTTCCTGAGGCTCAC -3′ und 5′- CACCGAGTGGAGCGCTGAGAA GAGG-3′/5′- AAACCCTCTTCTCAGCGCTCCACTC-3′ für PIGS; 5′-CACCGC GTGTGCAGACCACCTCCCG -3′/5′- AAACCGGGAGGTGGTCTGCACCGC-3′ und 5′- CACCGCACCATCACCTCCAAGGGCA-3′/5′- AAACTGCCCTTGGA GGTGATGGTGC-3′ für PIGT; für PIGU.

Die Oligos wurden so konzipiert, dass sie über klebrige Enden verfügen, die nach dem Annealing mit dem Typ-II-Restriktionsenzym BbsI (Kat. R3539S, NEB) kompatibel sind. Die sgRNA-Oligopaare, gelöst in einem Puffer mit 0,2 M NaCl, 0,1 mM EDTA und 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, wurden in äquimolaren Konzentrationen von 10 μM in einem PCR-Röhrchen gemischt. Die Oligonukleotide wurden zunächst durch 3-minütiges Erhitzen auf 95 °C denaturiert, bevor sie einem Annealing-Schritt mit allmählicher Abkühlung von 94 °C auf 25 °C bei 1 °C-Gradienten und einer 11-sekündigen Inkubation bei jeder Temperatur unterzogen wurden. Ein Mikroliter der getemperten Mischung wurde in den mit BbsI vorverdauten Vektor pX330 (50 ng) unter Verwendung von 5 Einheiten T4-Ligase (Kat. EL0011, Thermo Fisher Scientific) in einem 10-μL-Reaktionssystem bei Raumtemperatur (RT, 20 °C) ligiert –22 °C). Die Ligationsprodukte wurden in DH5α transformiert und die resultierenden Kolonien wurden zur DNA-Sequenzierung geschickt, um die gewünschten Konstrukte zu identifizieren.

Für die Bearbeitung des CRISPR-Cas9-Gens 8 μg der oben konstruierten sgRNA-kodierenden Plasmide, 0,16 μg pMaxGFP (später als FACS-Marker), 16 μl P3000 (Kat. L3000008, Thermo Fisher Scientific) und 250 μl Opti-MEM Medium (Kat. 31985070, Thermo Fisher Scientific) wurden gemischt und zu einer separat zubereiteten Mischung hinzugefügt, die 16 μl Lipofectamine 3000 und 250 μl Opti-MEM-Medium enthielt. Nach 15-minütiger Inkubation bei RT wurde die Mischung tropfenweise in eine 6-cm-Schale mit HEK293-Zellen mit 70–90 % Konfluenz gegeben. Die Zellen wurden in einem 5 % CO2-Inkubator bei 37 °C in einem Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), kultiviert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit 2 ml PBS gewaschen und mit 0,5 ml 0,1 % Trypsin (Kat. 25200056, Thermo Fisher Scientific) 3 Minuten lang bei 37 °C verdaut, bevor sie in 3 ml DMEM und 10 % FBS resuspendiert wurden Trypsin sättigen. Die Zellen wurden dann durch 5-minütige Zentrifugation bei RT bei 300 g geerntet, mit 10 ml PBS gewaschen und zur fluoreszenzunterstützten Zellsortierung (FACS) in 0,5 ml PBS resuspendiert. Insgesamt wurden ca. 800.000 Zellen in einem BD FACSAria Fusion-Gerät mit der Software BD FACS Diva (Version 8.0.3) nach grünem Fluoreszenzprotein (GFP) sortiert und die oberen 5 % (ca. 40.000) gesammelt. Diese Zellen wurden unter Verwendung von DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, seriell verdünnt und in Platten mit 96 Vertiefungen ausgesät, sodass in jeder Vertiefung durchschnittlich 2 oder 4 Zellen mit 100 μl Medium enthalten waren. Einzelne Zellen konnten sich 10–12 Tage lang in einem stationären CO2-Inkubator besiedeln. Vertiefungen, die eine einzelne Kolonie enthielten, wurden unter einem Mikroskop ausgewählt und die ausgewählten Zellen wurden mit 30 μl PBS gewaschen, bevor sie 2 Minuten lang bei 37 °C mit 30 μl 0,1 % Trypsin behandelt wurden. Danach wurden die Zellen in 200 μl DMEM und 10 % FBS resuspendiert und zur weiteren Kultivierung bzw. PCR-Identifizierung in zwei Teile (160 μl und 70 μl) geteilt. Der Genomwechsel wurde unter Verwendung der folgenden Primerpaare gescreent: GPAA1, 5'-AGGACTCCGGGTTTAGGT CT-3' und 5'-GTAGCCCAATCAAGGACCCC-3'; PIGK, 5'-TAAGCGATCTGC CCTACCAC-3' und 5'-CCCACAGGGAAGAATTC GGG-3'; SCHWEINE, 5′-GGCGAA ATGGGTGTCATGTG-3′ und 5′-GGCATGCAGATT TCCCTCCT-3′; PIGT, 5'-GACTGTGCTTAAGGAGGGCA-3' und 5'-AGCCTAA CGTTGCCAAACCC-3'; PIGU, 5′-GCACAAAATGGTCCGGCAG-3′ und 5′-AGGCCCATTAAGGCCAAG TT-3′. Zellpellets wurden in einer Mischung resuspendiert, die 10 μl 0,1 mM EDTA, 1 % Tween-20, 1 × Taq-Polymerasepuffer (50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 20 mM Tris HCl pH 8,4) und 1 mg mL-1-Proteinase enthielt K. Die Mischung wurde nacheinander 2 Stunden lang auf 56 °C und 30 Minuten lang auf 95 °C in einem Thermocycler erhitzt, bevor die PCR-Amplifikation 40 Zyklen lang durchgeführt wurde. Im Vergleich zu den Wildtyp-Zellen fehlte den PCR-Produkten von Knockout-Zellen (KO-Zellen) eine große Bande (GPAA1, 2 kb; PIGS, 2,7 kb; PIGK, 3,7 kb; PIGT, 3,4 kb; PIGU, 2,3 kb), zeigten aber eine kleinere Bande (GPAA1, 1 kb; PIGS, 0,7 kb; PIGK/PIGT/PIGU, 1,2 kb) aufgrund der Löschung. Die genomischen Deletionen wurden durch DNA-Sequenzierung der PCR-Produkte unter Verwendung der oben genannten Primer weiter verifiziert.

Um das Fehlen einer GPI-AP-Oberflächenexpression in den einzelnen KO-Zellen zu bestätigen, ließ man die oben als positiv identifizierten Zellen zwei weitere Passagen lang wachsen, bevor sie mittels Durchflusszytometrie analysiert wurden (siehe Abschnitt unten). Zellen, denen (1) CD59 auf der Zelloberfläche fehlte und (2) die Oberflächenexpression von CD59 durch ektopische Expression der entsprechenden Untereinheiten wiederhergestellt werden konnte, wurden entweder für weitere Durchflusszytometrietests verwendet oder in 10 % DMSO, 45 % FBS kryokonserviert in DMEM für lange Lagerung.

Um Zellen zu erzeugen, bei denen alle fünf GPI-T-Untereinheiten zerstört waren, wurde das oben beschriebene Verfahren gleichzeitig durchgeführt. Defektes GPI-T in dieser Zelllinie wurde durch DNA-Sequenzierung wie oben und durch das Fehlen einer CD59-Färbung bei der Transfektion einer Kombination von vier beliebigen, aber nicht allen fünf Untereinheiten bestätigt.

Wildtyp- oder GPI-T-KO-HEK293-Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % FBS, bei 37 °C in 24-Well-Platten in einem stationären CO2-Inkubator kultiviert. Plasmide (0,5 μg einzelne Plasmide oder insgesamt 0,5 μg mehrere Plasmide) wurden mit 1 μl P3000 und 25 μl Opti-MEM-Medium gemischt und zu einer separaten Mischung mit 1,5 μl Lipofectamine 3000 und 25 μl Opti-MEM-Medium hinzugefügt. MEM-Medium. Die Transfektion wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen mit PBS gewaschen, wie im vorherigen Abschnitt mit Trypsin behandelt und gewaschen und in 0,5 ml PBS resuspendiert. Mit Phycoerythrin (PE) markierter CD59-Antikörper (12-0596-42, Thermo Fisher Scientific, 1:500-Verdünnung) wurde mit den Zellen 15 Minuten lang im Dunkeln inkubiert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und in ~0,3 ml PBS für die Durchflusszytometrie (Beckman CytoFlex LX-Gerät mit Software CytExpert (Version 2.4.0.28)) resuspendiert, überwacht bei zwei Wellenlängenpaaren (488/525 für GFP, 561/585 für PE). Zellen (typischerweise 40.000) wurden mithilfe des GFP-Kanals (aus der Expression der TGP-markierten GPI-T-Untereinheit(en)) gesteuert und mit der Software FlowJo (Version v10) auf ein positives Signal für den PE-Kanal (zur Oberflächenfärbung von CD59) analysiert. 0,7, BD Life Sciences). Ein Beispiel für die Gating-Strategie finden Sie in der ergänzenden Abbildung 12.

Für die scheinbare Aktivität von GPI-T-Mutanten wurde der Prozentsatz der Immunfärbung von CD59 in einfach mit der Mutante transfizierten KO-Zellen auf die Negativkontrolle normalisiert (dieselbe Zelllinie, transfiziert mit dem TGP-markierten Patched, einem nicht verwandten Membranprotein). und die Positivkontrolle (die gleiche Zelllinie, transfiziert mit Plasmiden, die das Gen der Wildtyp-Untereinheit tragen). Die Expression und Integrität aller Mutanten (TGP-markiert) wurde auch separat durch SDS-PAGE-In-Gel-Fluoreszenz unter Verwendung eines Fujifilm-Geräts mit FLA-9000-Software bestätigt (ergänzende Abbildung 10). Die in dieser Arbeit berichteten Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten. Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism 9.0.0 durchgeführt.

GPI-T wurde in Expi293-Zellen exprimiert, die mit fünf Plasmiden, die alle Untereinheiten trugen, unter Verwendung von Polyethylenimin (PEI, Kat. 23966-1, Polysciences) co-transfiziert wurden. Kurz gesagt wurden 0,5 l Zellen (>95 % Lebensfähigkeit) mit einer Dichte von 2 × 106 ml–1 zweimal verdünnt und bei 37 °C in einem 3-l-Kolben in einem CO2-Inkubator kultiviert, um wieder 2 × 106 ml– zu erreichen 1 (dauert normalerweise einen Tag). Sechs Milligramm Plasmide und 12 mg PEI wurden 20 Minuten lang bei RT in 100 ml Medium gemischt, bevor sie zu 1 l Zellkultur hinzugefügt wurden. Natriumvalproat (Kat. P4543, Sigma) wurde bis zu einer Endkonzentration von 2 mM zugegeben. Die Zellen wurden nach 48 Stunden durch 15-minütige Zentrifugation bei 1500 g geerntet, einmal mit PBS-Puffer gewaschen, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert.

GPI-T wurde durch Tandem-Affinitätschromatographie und anschließende Gelfiltration gereinigt. Alle Schritte wurden bei 4 °C durchgeführt. Zellen aus 4 l Kultur wurden mit Solubilisierungspuffer resuspendiert, der 1 % Laurylmaltoseneopentylglykol (LMNG)/0,1 % Cholesterylhemisuccinat (CHS), 150 mM NaCl, 1 mM PMSF, 1 × Proteininhibitor-Cocktail (Kat. B14001, Bimake) enthielt. und 50 mM Tris-HCl pH 8,0 hinzugefügt und 2 Stunden lang leicht gerührt. Zelltrümmer wurden durch einstündiges Zentrifugieren bei 4.4200 g entfernt. Der Überstand wurde gesammelt, mit 4,5 ml voräquilibrierten Strep-Tactin-Kügelchen (Kat. SA053100, Smart-lifesciences) gemischt und 2 Stunden lang vorsichtig gerührt. Die Perlen wurden in eine Schwerkraftsäule (Kat. 7321010, Bio-Rad) gepackt und mit 5 Säulenvolumen (CV) 0,01 % LMNG, 0,001 % CHS und 0,1 % Digitonin (Kat. D82515, ABCone) gewaschen, bevor sie mit 0,2 inkubiert wurden % Digitonin in Puffer A (150 mM NaCl, 20 mM Tris HCl pH 8,0) für 1 Stunde. Die Perlen wurden dann mit 1,5 CV 0,2 % Digitonin und 5 CV 0,1 % Digitonin in Puffer A gewaschen, bevor sie mit 5 mM d-Desthiobiotin (Kat. Sc-294239A, Santa Cruz) und 0,1 % Digitonin in Puffer A eluiert wurden Die gepoolten Fraktionen wurden so eingestellt, dass sie 10 mM Imidazol enthielten, bevor sie mit 1 ml Ni-NTA-Perlen (Kat. 1018401, Qiagen) 1 Stunde lang unter leichtem Rühren inkubiert wurden. Die Perlen wurden in eine Schwerkraftsäule gepackt, mit 5 CV 10 mM Imidazol gewaschen, bevor sie mit 0,3 M Imidazol in 0,1 % Digitonin in Puffer A eluiert wurden. Die gepoolten Fraktionen wurden mit einem 100-kDa-Cut-off-Konzentrator (Kat. UFC810096, Merck Millipore) und durch Gelfiltration auf einer Superose 6 10/300 GL-Säule (Kat. 29-0915-96, Cytiva) in einem Laufpuffer mit 0,1 % Digitonin in Puffer A weiter gereinigt. Das Elutionsprofil wurde mit einem Bio überwacht -Rad NGC-Chromatographiesystem mit Software ChromLab (Version 3.3.0.09). Peak-Fraktionen wurden gepoolt und auf 14–20 mg mL-1 für die Kryo-EM-Gittervorbereitung konzentriert. Die Proteinkonzentration wurde durch Messung von A280 unter Verwendung eines theoretischen molaren Extinktionskoeffizienten von 596.940 M−1 cm−1 unter der Annahme einer äquimolaren Stöchiometrie bestimmt. Die Qualität des gereinigten Proteins wurde durch In-Gel-Fluoreszenz und Coomassie-Färbung SDS-PAGE überprüft (Abb. 1b und unbeschnittene Bilder in Quelldaten).

Gereinigter GPI-T-Komplex (2,5 μl) wurde auf glimmentladene Quantifoil Au R1.2/1.3-Gitter (300 Mesh) aufgetragen und 3 s lang mit Filterpapier mit einer Blotting-Kraft von 5 bei 4 °C mit 100 % geblottet. Luftfeuchtigkeit in einer Vitrobot Mark IV (FEI)-Kammer, bevor sie in flüssigem Ethan kryogekühlt wird.

Die Gitter wurden in ein Titan-Krios-Kryoelektronenmikroskop (Thermo Fisher) geladen, das bei 300 kV mit einer 50-μm-Kondensorlinsenapertur, Punktgröße 5 und 165.000-facher Vergrößerung betrieben wurde (entsprechend einer kalibrierten Probenahme von 0,85 Å pro physikalischem Pixel). und ein K2-Direktelektronengerät, das mit einem BioQuantum-Energiefilter ausgestattet ist und bei 20 eV betrieben wird (Gatan). Filmstapel wurden automatisch mit der EPU2-Software (Version 2.91 Thermo Fisher) gesammelt, wobei der K2-Detektor im Zählmodus mit einer Aufzeichnungsrate von 5 Rohbildern pro Sekunde und einer Gesamtbelichtungszeit von 5 s arbeitete, was 25 Bilder pro Stapel und eine Gesamtdosis ergab von 52,5 e–/Å2.

Kryo-EM-Daten wurden mit Relion (v3.1)62 und CryoSPARC (v3.1)63 verarbeitet. Die Bildbewegung von insgesamt 4.705 Bildstapeln wurde durch den MotionCor264-Wrapper in Relion korrigiert. Belichtungsgewichtete Durchschnittswerte wurden dann in CryoSPARC importiert und die Parameter der Kontrastübertragungsfunktion für jede mikroskopische Aufnahme wurden von CTFFIND465 geschätzt. Die 2D-Klassifizierungsvorlage wurde aus einer kleinen Menge von Partikeln durch Blob-Picking generiert. Mit dieser Vorlage wurden insgesamt 2.959.791 Partikel automatisch ausgewählt und mit einer Boxgröße von 280 Pixeln extrahiert und mehreren Runden der 2D-Klassifizierung und heterogenen Verfeinerung (3D-Klassifizierung) unterzogen, um Verunreinigungen oder Partikel schlechter Qualität zu entfernen. Ein Satz von 329.617 guten GPI-T-Partikeln wurde erhalten und für die Bayes'sche Politur in Relion umgewandelt, die anschließend zur heterogenen Verfeinerung zurück in CryoSPARC importiert wurde, was die Erstellung einer 2,66 Å-Karte aus 179.871 Partikeln durch ungleichmäßige Verfeinerung (NU-Verfeinerung) ermöglichte ). Eine weitere Runde heterogener Verfeinerung (3D-Klassifizierung) mit phasenrandomisierten Referenzkarten (20/30/40 Å) grenzte den Datensatz auf 151.590 Partikel ein, die zur Erstellung der endgültigen 2,53 Å-Karte durch lokale Verfeinerung mit entfernter Membranmizelle verwendet wurden Maske. Die Auflösung dieser Karten wurde intern in CryoSPARC durch Goldstandard-Fourier-Shell-Korrelation unter Verwendung des 0,143-Kriteriums geschätzt. Einzelheiten zur Datenverarbeitung finden Sie in den Zusatzinformationen (Ergänzungsabbildung 3) und der Ergänzungstabelle 1.

Das Modell wurde von Anfang an mit Coot66 (Version 0.9.6) erstellt, basierend auf der Aminosäuresequenz und anhand der Kryo-EM-Dichte unter Verwendung aromatischer Reste, Glykosylierungsstellen und Disulfidbindungen als Referenzmarker. Das Modell wurde mit Phenix verfeinert. real_space_refine67 (Version 1.19.2-4158), was einen durchschnittlichen Modell-Map-Korrelationskoeffizienten (CCmask) von 0,84 ergibt. Strukturen wurden mit UCSF ChimeraX1.168 und PyMOL (Version 2.3.3) (https://pymol.org/2/) visualisiert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Daten, die diese Studie stützen, sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Die in dieser Studie generierten Plasmide und Knockout-Zelllinien sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor (DL) erhältlich. Die Kryo-EM-Dichtekarte wurde in der Electron Microscopy Data Bank (EMDB) mit dem Zugangscode EMD-32582 (GPI-Transamidase-Komplex) und die Strukturkoordinaten in der RSCB Protein Data Bank (PDB) unter der Zugangsnummer hinterlegt 7WLD https://doi.org/10.2210/pdb7WLD/pdb (GPI-Transamidase-Komplex). Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Kryo-EM-Daten wurden im SKLB West China Cryo-EM Center gesammelt und im Duyu High-Performance Computing Center der Sichuan-Universität verarbeitet. Wir danken den Mitarbeitern des Zentrums für Kryo-EM der Fudan-Universität und des Kryo-EM-Zentrums der National Facility for Protein Science in Shanghai für technische Unterstützung und Unterstützung. Wir danken Dr. Feilong Meng, Liu Daisy Liu und Hai Jiang sowie Herr Yin Chen für die Beratung zu CRISPR-Cas9. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (82151215, 31870726, DL; 32171194, QQ; 82041016, 32070049, ZS), dem Strategic Priority Research Program von CAS (XDB37020204, DL) und CAS Facility-based Open Research unterstützt Programm (2017, DL), Kommission für Wissenschaft und Technologie der Stadt Shanghai (20ZR1466700, DL), Ministerium für Wissenschaft und Technologie von China (2021YFA1301900, ZS) und die Startgelder des Shanghai Stomatological Hospital & School of Stomatology der Fudan-Universität (2020, QQ).

Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: Yidan Xu, Guowen Jia, Tingting Li, Zixuan Zhou.

Staatliches Schlüssellabor für Molekularbiologie, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, University of CAS, Chinese Academy of Sciences (CAS), 320 Yueyang Road, 200030, Shanghai, China

Yidan Xu, Tingting Li, Yitian Luo, Juan Bao und Dianfan Li

Staatliches Schlüssellabor für Biotherapie und Krebszentrum, Abteilung für Geriatrie und Nationales klinisches Forschungszentrum für Geriatrie, West China Hospital, Sichuan-Universität, 610044, Chengdu, China

Guowen Jia & Zhaoming Su

Shanghai Stomatological Hospital, School of Stomatology, Shanghai Key Laboratory of Medical Epigenetics, International Co-laboratory of Medical Epigenetics and Metabolism (Ministerium für Wissenschaft und Technologie), Institute of Biomedical Sciences, Department of Systems Biology for Medicine, Fudan University, 200032, Shanghai , China

Zixuan Zhou, Yulin Chao und Qianhui Qu

School of Life Science and Technology, ShanghaiTech University, 393 Middle Huaxia Road, 201210, Shanghai, China

Yitian Luo

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YX hat ein Reinigungsprotokoll erstellt. TL und YX reinigten den Komplex. YX konstruierte KO-Zellen und führte Funktionstests durch. YL, YC und ZZ haben Kryo-EM-Gitter vorbereitet und überprüft. GJ sammelte Kryo-EM-Daten unter der Aufsicht von ZSZZ und GJ verarbeitete Kryo-EM-Daten und erstellte die endgültige Karte. JB half beim molekularen Klonen. DL hat das Projekt initiiert. DL und QQ haben das Manuskript mit Beiträgen von YL, TL, YX, ZZ und ZS geschrieben

Korrespondenz mit Zhaoming Su, Qianhui Qu oder Dianfan Li.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Xu, Y., Jia, G., Li, T. et al. Molekulare Einblicke in die Biogenese von Glykosylphosphatidylinositol-Ankerproteinen. Nat Commun 13, 2617 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30250-6

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Eingegangen: 23. Februar 2022

Angenommen: 22. April 2022

Veröffentlicht: 12. Mai 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30250-6

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