Green-synchrone spektrofluorimetrische Methode zur gleichzeitigen Bestimmung von Agomelatin und Venlafaxin in menschlichem Plasma in Teilen pro Milliarde

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 22559 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Für die gleichzeitige Bestimmung von Venlafaxin und Agomelatin in Arzneimitteln und biologischen Flüssigkeiten wurde eine neuartige nachhaltige, einfache, empfindliche und umweltfreundliche spektrofluorimetrische Methode entwickelt. Die Methode basiert auf synchroner Fluoreszenzspektroskopie, bei der Venlafaxin und Agomelatin bei 276 bzw. 328 nm mit einem Δλ von 20 nm gemessen wurden. Die potenziellen Faktoren, die die Fluoreszenzintensität beeinflussen, wurden durch die One-Factor-at-a-Time-Strategie (OFAT) optimiert, bei der die synchrone Fluoreszenzintensität mithilfe eines mizellaren Systems mit 1 % w/v Natriumdodecylsulfat deutlich erhöht wurde. Die Methode wurde vollständig validiert und zeigte eine hervorragende Linearität (r2 > 0,999 für beide Medikamente) mit sehr niedrigen Nachweisgrenzen (LODs) im Bereich von 0,14–0,84 ng/ml. Folglich wurde der vorgeschlagene Ansatz effizient zur Analyse der gleichzeitig verabreichten Arzneimittel in ihren Arzneimitteln und in dotiertem menschlichem Plasma mit einer hervorragenden prozentualen Wiederfindung zwischen 97,4 und 102,2 % eingesetzt. Schließlich wurde die Umweltfreundlichkeit der Methode mithilfe verschiedener metrischer Tools bewertet, darunter Green Analytical Procedure Index (GAPI) und Analytical GREEnness (AGREE), die ihre hervorragende Umweltfreundlichkeit bewiesen.

Depression (eine häufige psychische Störung) ist eine der häufigsten psychiatrischen Erkrankungen. Schwere depressive Störungen treten häufiger bei Patienten auf, die einen Schlaganfall (10–27 %), einen Myokardinfarkt (40–65 %) und Krebs (20–25 %) erlitten haben. Antidepressiva werden zur Behandlung aller Arten schwerer depressiver Störungen eingesetzt1. In Ägypten ist die Verschreibung von Antidepressiva in den letzten Jahren deutlich gestiegen. Die selektiven Serotonin-Noradrenalin-Wiederaufnahmehemmer (SNRIs) und die Serotonin-2C (5-HT2C)-Antagonisten sind zwei bedeutende Klassen von Antidepressiva, die in der Psychiatrie häufig verschrieben werden2. Ihre klinische Wirksamkeit ist mit der herkömmlicher trizyklischer Antidepressiva vergleichbar, es fehlen jedoch einige der negativen kardiovaskulären und anticholinergen Nebenwirkungen, die häufig mit diesen Medikamenten verbunden sind3.

Venlafaxin (VFX), (1-[2-(Dimethylamino)-1-(4-methoxyphenyl)ethyl]cyclohexanol), ist ein SNRI-Antidepressivum der zweiten Generation (Abb. 1a)4. Im Vergleich zum Antidepressivum Fluoxetin zeigte VFX einen raschen Wirkungseintritt und eine verbesserte Reaktion5. Zu den häufigsten Nebenwirkungen des VFX-Einsatzes gehören jedoch Depressionen, Serotoninvergiftung, Krampfanfälle oder Probleme mit der Herzleitung6,7. Agomelatin (AGM), auch bekannt als N-(2-(7-methoxy-1-naphthyl)ethyl)acetamid, ist ein neues Antidepressivum8, das sowohl als 5HT-2C-Antagonist als auch als Agonist an den melatonergen MT1/MT2-Rezeptoren wirkt9 ( Abb. 1b). In klinischen Studien wurde eine vergleichbare Wirksamkeit wie SSRIs wie Paroxetin und SNRIs wie VFX nachgewiesen10. Das Medikament zeigte zahlreiche Vorteile gegenüber herkömmlichen Antidepressiva, darunter weniger sexuelle Nebenwirkungen als VFX, positive Auswirkungen auf Schlafstörungen bei Depressionen und Unabhängigkeit von Nebenwirkungen wie Gewichtszunahme und Serotonin-Syndrom11.

Strukturformeln von (a) Venlafaxin, (b) Agomelatin.

Daher scheint es eine klinische Rechtfertigung für die Kombination dieser Antidepressiva zur Behandlung der verschiedenen Symptome des depressiven Syndroms zu geben. AGM ist aufgrund seiner hohen Verträglichkeit und seines Sicherheitsprofils im Vergleich zu anderen Antidepressiva ein beliebtes Medikament in der Kombinationstherapie mit SSRIs oder SNRIs12. Obwohl VFX und AGM über unterschiedliche Wirkmechanismen verfügen, scheinen sie in Kombination am besten zusammenzuarbeiten13. Darüber hinaus kann ein Teil der Patienten, die nur unzureichend auf VFX oder AGM allein ansprechen, aufgrund ihrer relativen Sicherheit und des geringeren Risikos von Arzneimittelwechselwirkungen von deren kombinierter Anwendung profitieren14,15. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kombination von AGM und VFX bei schweren Depressionen eine gute therapeutische Begründung, eine bessere Verträglichkeit und weniger Nebenwirkungen aufweist14.

In der klinischen Praxis wird häufig eine Trial-and-Error-Strategie zur Dosistitration eingesetzt, um die optimale Dosis einer Person für Antidepressiva zu ermitteln. Die therapeutische Arzneimittelüberwachung16,17,18 ist jedoch eine weit verbreitete Methode zur Bestimmung der idealen Dosierung eines einzelnen Patienten, die bei Verwendung mit Antidepressiva stets die Wirksamkeit und Sicherheit verbessert.

Bisher wurden nur wenige Berichte zur Analyse von AGM in seinen Arzneimitteln und in biologischen Flüssigkeiten angewendet. Diese Berichte umfassten Spektrofluorimetrie19,20, HPLC-UV21 und LC-MS22. Darüber hinaus wurden verschiedene Analysemethoden zur Schätzung von VFX in verschiedenen Matrizen entwickelt23,24,25. Allerdings wurden unseres Wissens nach keine Berichte zur gleichzeitigen Bestimmung der gleichzeitig verabreichten Arzneimittel AGM und VFX gefunden, weder in ihren Arzneimitteln noch in biologischen Flüssigkeiten. Dies erfordert die Entwicklung eines geeigneten Ansatzes für deren gleichzeitige Bestimmung innerhalb ihrer therapeutischen Wirkstoffspiegel.

Der spektrofluorimetrische Ansatz ist bekannt für seine herausragende Empfindlichkeit und Selektivität26,27, obwohl bei der Bestimmung von Mehrkomponentenproben aufgrund der Breitbandspektrumüberlappungen Selektivitätsprobleme auftreten können. Die synchrone Fluoreszenzspektroskopie (SFS) spielt eine entscheidende Rolle bei der Analyse von Mischungen mit überlappenden Spektren28,29. SFS hat sich als äußerst effizient bei der Charakterisierung und Quantifizierung einer Vielzahl von Verbindungen erwiesen30. Aufgrund der verbesserten spektralen Auflösung, besseren Selektivität, reduzierten Lichtstreuung und Einfachheit der SFS-Spektren ist sie der herkömmlichen Fluoreszenzspektroskopie vorzuziehen31. SFS wurde dank seiner schmalen und scharfen Spektren für die erfolgreiche quantitative Schätzung verschiedener Verbindungen in nur einem Durchgang eingesetzt32,33,34.

Unser Ziel war es daher, eine intelligente, empfindliche und umweltfreundliche Methode zur gleichzeitigen Quantifizierung von VFX und AGM in ihren Arzneimitteln und biologischen Flüssigkeiten einzuführen. Berücksichtigt wurde auch die Notwendigkeit, eine nachhaltige Methode anzuwenden, die wissenschaftlich begründet ist und den Verbrauch gefährlicher Substanzen und Lösungsmittel eliminiert und gleichzeitig eine geringere Umweltbelastung aufweist. Mit der geringsten Umweltbelastung konnten wir VFX und AGM mithilfe der bewährten SFS-Methode bestimmen. Eine beträchtliche mizellare Verstärkung der Fluoreszenzintensitäten der untersuchten Medikamente wurde auch unter Verwendung von Natriumdodecylsulfat (SDS) als mizellares System erreicht. Die Methode könnte zur gleichzeitigen Schätzung der oben genannten Arzneimittel in Pharmazeutika und biologischen Flüssigkeiten in Teilen pro Milliarde verwendet werden. Darüber hinaus ist die Strategie einfach, frei von gefährlichen Lösungsmitteln und erschwinglich, da sie eine Technik verwendet, die in den meisten Forschungslabors verfügbar ist.

VFX (98,0 %) wurde von Wako Pure Chemicals Ltd. (Osaka, Japan) gekauft, während AGM (98,0 %) von Tokyo Chemical Industries Co. (Tokio, Japan) gekauft wurde. Britton-Robinson-Puffer, Brij-35, Cetrimid, β-Cyclodextrin, Natriumdodecylsulfat, Tween-80, Ethanol, Methanol und Acetonitril wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen.

Efexor XR®-Kapseln (75 mg VFX/Kapsel, Charge Nr. FJ4605, Pfizer Ireland Pharmaceuticals, Newbridge Co. Kildare, Republik Irland) und Agovald®-Tabletten (25 mg AGM/Tablette, Charge Nr. M1120121-8–24, Mash Premiere Co., New York, USA) wurden in einer örtlichen ägyptischen Apotheke gekauft. Für menschliche Plasmaproben wurden sie von den Mansoura University Hospitals (Mansoura, Ägypten) bereitgestellt und bis zur Verwendung bei –20 °C aufbewahrt, bevor sie vorsichtig aufgetaut wurden. Britton-Robinson-Puffer (0,02 M) wurde in doppelt destilliertem Wasser hergestellt, um pH-Bereiche von 2 bis 12 abzudecken. Zusätzlich wurden organisierte Medienlösungen mit einer Konzentration von 1,0 % v/v oder w/v hergestellt.

Die Messungen der synchronen Fluoreszenzspektren wurden mit einem Agilent Cary Eclipse Fluoreszenzspektrometer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA 95,051, USA) durchgeführt. Die Vorrichtung wurde bei einer Hochspannungseinstellung von 800 V und einer Spaltbreite von 5 nm betrieben. Bei Δλ = 20 nm wurden Spektren mit einem Scanbereich von 200–400 nm aufgezeichnet. Zu den weiteren in der Studie verwendeten Geräten gehörten ein Ultraschallbad (SS 101H 230, USA), eine Zentrifuge (2-16P, Deutschland), ein Vortexmischer (IVM-300p, Gemmy Industrial Corp., Taiwan) und ein pH-Meter ( NV P-901, Belgien). Membranfilter (0,45 mm) wurden von Phenomenex, USA, bezogen.

Stammlösungen von AGM und VFX wurden getrennt in einer Konzentration von 100,0 μg/ml hergestellt, indem 10,0 mg jedes Medikaments in 100,0 ml doppelt destilliertem Wasser als Endvolumen gelöst wurden. Danach wurden Arbeitslösungen durch weiteres Verdünnen der Stammlösungen mit Wasser erhalten. Die resultierenden Lösungen könnten bei Lagerung bei 4 °C mindestens eine Woche lang stabil sein.

Aliquote der Stammlösungen wurden in einen Satz 5-ml-Messkolben mit Konzentrationsbereichen von 20,0–1000,0 bzw. 5,0–200,0 ng/ml für VFX und AGM überführt. Anschließend wurde den Lösungen ein Milliliter der 1 %igen SDS-Lösung zugesetzt, diese wurden dann ordnungsgemäß mit bidestilliertem Wasser verdünnt und sorgfältig gemischt. Beide Medikamente wurden bei Δλ = 20 nm mit 5-nm-Fenstern im Bereich von 200–400 nm gescannt. Die synchronen Fluoreszenzintensitäten (SFIs) wurden bei 276 nm und 328 nm für VFX bzw. AGM gemessen. Ebenso wurden Blindproben erstellt. Der korrigierte SFI gegen die Endkonzentration des Arzneimittels (ng/ml) wurde aufgetragen, um die Kalibrierungsdiagramme zu erhalten und die Regressionsgleichungen zu entwickeln.

Aliquote der Stammlösungen jedes Arzneimittels wurden in 5-ml-Kolben überführt, um fünf synthetische Mischungen mit unterschiedlichen Verhältnissen und innerhalb des linearen Bereichs von VFX und AGM zu erzeugen. Nach Zugabe von einem Milliliter 1 % SDS wurde das Volumen mit bidestilliertem Wasser angepasst. Die Messungen wurden wie im Abschnitt „Erstellung von Kalibrierkurven“ beschrieben durchgeführt. Die Konzentrationen wurden mithilfe der jeweiligen Regressionsmodelle ermittelt.

Das Äquivalent des Inhalts von zehn Agovald®-Tabletten oder Efexor XR®-Kapseln wurde einzeln abgewogen und fein gemahlen. Separat wurde eine genaue Menge des Pulvers, die 10,0 mg AGM oder VFX entsprach, in kleine Kolben gegeben und dann 50 ml doppelt destilliertes Wasser hinzugefügt. Die Lösungen wurden 20 Minuten lang beschallt, dann in saubere, trockene 100-ml-Messkolben filtriert und mit dem gleichen Lösungsmittel auf das gewünschte Volumen aufgefüllt. Das oben beschriebene Verfahren wurde durchgeführt, nachdem zunehmend größere Mengen des Filtrats in 5-ml-Messkolben überführt wurden. Zur Ermittlung der Sollinhalte von Tabletten bzw. Kapseln wurden die entsprechenden Regressionsgleichungen verwendet.

Separat wurde 1,0 ml menschliches Plasma in einen Satz von 15 ml Zentrifugenröhrchen gegeben. Plasmaproben wurden getrennt mit Aliquots der VFX- und AGM-Lösungen versetzt, um Endkonzentrationen im Bereich von 50,0–200,0 bzw. 5,0–15,0 ng/ml zu erreichen. Die Lösungen wurden dann 2 Minuten lang gevortext, gefolgt von der Proteinfällung durch Auffüllen auf 5 ml mit Methanol. Danach wurden die Röhrchen 15 Minuten lang bei 6000 U/min zentrifugiert, um eine Phasentrennung der Medikamente vom Plasmainhalt zu ermöglichen. Anschließend wurden 1-Milliliter-Aliquote des filtrierten Überstands in 5-ml-Messkolben überführt. Anschließend wurde 1 ml 1 %iges SDS zugegeben, gefolgt von destilliertem Wasser, um es bis zur Marke zu vervollständigen.

Qualitätskontrollproben sollten aus verschiedenen Stammlösungen gewonnen werden, indem menschliches Plasma mit einer bekannten Menge im Bereich der Arzneimittellinearität versetzt wird. Wie bereits erwähnt, wurden die korrigierten SFIs parallel zu einer Blindprobe gemessen. Die korrigierten SFIs wurden dann gegen die Konzentrationen jedes Arzneimittels aufgetragen, um Regressionsgleichungen zu erstellen.

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der institutionellen Ethikgenehmigung des zuständigen Universitätsausschusses (Ausschuss für Forschungsethik an der Fakultät für Pharmazie, Kafrelsheikh-Universität, Kafrelsheikh, Ägypten) durchgeführt.

Das zuvor beschriebene Verfahren wurde in fünf Wiederholungen an einem Teil des hergestellten Überstands wiederholt. Mithilfe der entsprechenden Regressionsgleichung wurde die nominelle Konzentration der getesteten Arzneimittelmischungen in der dotierten Plasmaprobe ermittelt. Gleichzeitig wurde ein Blindexperiment mit der Plasmaprobe ohne Zugabe der Arzneimittellösung durchgeführt.

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt und diese Arbeit wurde vom Ausschuss für Forschungsethik der Fakultät für Pharmazie der Kafrelsheikh-Universität, Kafrelsheikh, Ägypten, genehmigt (Protokollcode KFS-Ph-001-22).

Vom Ausschuss für Forschungsethik der Fakultät für Pharmazie der Kafrelsheikh-Universität, Kafrelsheikh, Ägypten, wurde eine Ausnahmegenehmigung für die Einwilligung nach Aufklärung für die aktuelle Studie eingeholt.

Wässrige VFX- und AGM-Lösungen zeigen nach Anregung bei 272 bzw. 226 nm eine native Fluoreszenz bei λem von 301 und 357 nm. Folglich schließt die Überlappung ihrer Emissionsfluoreszenzspektren ihre gleichzeitige Schätzung aus (Abb. 2). Die synchrone Fluoreszenzspektroskopie (SFS) war bisher die geeignete Option, um die beiden Medikamente gleichzeitig in nur einem Scan zu analysieren. SFS bietet zusätzliche Vorteile, darunter eine verbesserte Selektivität, eine Reduzierung der spektralen Überlappung, eine Vereinfachung sowie sein scharfes und schmales Spektrum mit einer beträchtlichen Toleranz gegenüber exogenen Verunreinigungen, insbesondere bei der Analyse biologischer Matrizen und Dosierungsformen. Dementsprechend wurde die SFS-Methode optimiert, um die spektrale Überlappung zu reduzieren und die Empfindlichkeit zu erhöhen.

Anregungs- und Emissionsspektren von VFX (1000,0 ng/ml) (a, a*) und AGM (4,0 ng/ml) (b, b*).

Durch die Verwendung der One-Factor-at-a-time (OFAT)-Strategie (Änderung eines einzelnen Faktors nach dem anderen, während die anderen konstant bleiben) können mehrere experimentelle Faktoren, die den SFI der betreffenden Arzneimittel beeinflussen (einschließlich Δλ-Änderung, Verdünnung von Lösungsmitteln, pH-Wert und organisierte Medien) wurden bewertet und optimiert.

Eine Änderung von Δλ hat offensichtliche Auswirkungen auf die Spitzenauflösung und Empfindlichkeit. Die Signalstärke, die Spektralstruktur und die Breite des Synchronbandes werden alle direkt beeinflusst. Auf einer großen Δλ-Skala (10–140 nm) wurde das SFS von VFX und AGM untersucht. Die SF-Spektren der beiden Arzneimittel wurden in einem einzigen Durchgang mit ausreichender Empfindlichkeit bei einem Δλ von 20 nm aufgenommen, was sich als angemessen erwies und für beide Arzneimittel zuverlässige Ergebnisse lieferte. Die gut aufgelösten Spektren, die bei 276 nm für VFX und 328 nm für AGM erzeugt wurden, ermöglichten die störungsfreie Trennung der beiden Medikamente bei gleichzeitiger Analyse. Daher wurde festgestellt, dass die optimale Wellenlänge für beide Medikamente Δλ = 20 nm ist (Abb. 3). Ein niedrigerer Δλ-Wert als dieser Wert zeigte einen verringerten SFI sowohl für VFX als auch für AGM, während Werte über 20 nm zu überlappenden Spektren führten. Folglich wurde bei der Untersuchung weiterhin ein Δλ von 20 nm verwendet.

Synchrone Fluoreszenzspektren von (1) ac, VFX (600,0, 800,0 und 1000,0 ng/ml) und (2) df, AGM (80,0, 100,0 und 200,0 ng/ml) bei Δλ = 20 nm.

Verschiedene Verdünnungslösungsmittel wie doppelt destilliertes Wasser, Acetonitril, Methanol und Ethanol wurden untersucht. Der größte SFI für VFX und AGM mit hoher Auflösung wurde mit Wasser erzielt (Abb. 4a), was der vorgeschlagenen Methode einen zusätzlichen Vorteil im Hinblick auf die Nachhaltigkeit verleiht. Dieser Einfluss nimmt mit zunehmender Lösungsmittelpolarität zu. Im Gegensatz zu unpolaren Molekülen zeigen nur polare Fluorophore oft eine stärkere Affinität zur Lösungsmittelpolarität27. Die Dielektrizitätskonstante (Ɛ) ist ein Maß für die Polarität eines Lösungsmittels. Je größer die Dielektrizitätskonstante, desto polarer ist das Lösungsmittel35. Darüber hinaus sind AGM und VFX polar genug, um in doppelt destilliertem Wasser einen hohen SFI zu zeigen. Andererseits führten Acetonitril, Methanol und Ethanol zu hohen Blindwerten und verringerten die SFIs der beiden Arzneimittel (Abb. 4a). Daher wurde Wasser als Verdünnungslösungsmittel der Wahl verwendet.

Einfluss verschiedener Verdünnungslösungsmittel (a), pH-Wert (b), organisierter Medien (c) und SDS-Volumen (d) auf den SFI von 1000,0 ng/ml VFX und 100,0 ng/ml AGM.

Der SFI von wässrigen AGM- und VFX-Lösungen über einen weiten pH-Bereich (2–12) wurde unter Verwendung von 0,02 M Britton-Robinson-Puffer untersucht. Bei einer Änderung des pH-Werts, weder im sauren noch im alkalischen Bereich, wurde kein signifikanter Effekt beobachtet. Darüber hinaus nahm der SFI von VFX allmählich ab, wenn der pH-Wert über 7 stieg (Abb. 4b). Daher wurde in den Konsequenzen kein Puffer verwendet.

Die Fähigkeit verschiedener organisierter Medien, den SFI von AGM und VFX zu verbessern, wurde bei einer Konzentration bewertet, die höher als ihre kritischen Mizellenkonzentrationen (CMC) ist34. Dazu gehörten SDS, Cetrimid, Tween-80, Brij-35 und β-Cyclodextrin. Es wurde festgestellt, dass SDS die SFIs von VFX und AGM um etwa 53 % bzw. 16 % ihrer nativen Fluoreszenz deutlich steigert (Abb. S1, Zusatzmaterial). Die Verstärkung in dieser Mizelle wird offensichtlich durch die Hemmung eines nichtstrahlenden Prozesses verursacht, der auf einen oder mehrere der folgenden Gründe zurückzuführen ist: Sequestrierung aus Wasser, was zu einer erheblichen Abnahme der Polarität der Mikroumgebung des Fluorophors sowie zu einem Anstieg der Polarität führt die Mikroviskosität. Dies erklärt, warum die Zugabe von 1 % w/v SDS den SFI von AGM und VFX deutlich verbesserte. Andererseits wurde festgestellt, dass Cetrimid den FI beider Arzneimittel signifikant senkte (Abb. 4c). Bei Brij-35 und β-Cyclodextrin wurde keine Verstärkung beobachtet und störende Peaks wurden bei 285 bzw. 278 nm festgestellt. Für Tween-80 wurde sogar eine Verbesserung des SFI von AGM beobachtet; Es wurde ein hoher Leerwert mit interferierenden Peaks bei 321 und 282 nm gemessen. Infolgedessen wurde SDS in den Konsequenzen für die selektive Verstärkung des SFI beider Arzneimittel eingesetzt. Daher wurden unterschiedliche SDS-Volumina im Bereich von 0,5–3,0 ml untersucht. Ein Milliliter 1 % SDS erwies sich als optimal für den höchsten SFI beider Arzneimittel (Abb. 4d).

Die vorgeschlagene Methode wurde gemäß den ICH-Richtlinien36 validiert. Zu den Validierungsstudien gehörten Linearität und Bereich, Präzision, Richtigkeit, Nachweisgrenzen (LOD) und Quantifizierungsgrenzen (LOQ) sowie Selektivität.

Erstens zeigte die Methode eine hervorragende Linearität (r2 > 0,999, für beide Medikamente) über die Bereiche 20,0–1000,0 und 5,0–200,0 ng/ml für VFX bzw. AGM (Abb. S2, Zusatzmaterial). Darüber hinaus wurden sowohl LOD als auch LOQ aus 3,3 × (Sa/b) bzw. 10 × (Sa/b) berechnet, wobei Sa die Standardabweichung des Achsenabschnitts und b die Steigung der Kalibrierungskurven ist. Die erhaltenen niedrigen LODs und LOQs (Tabelle 1) bestätigen die hohe Empfindlichkeit der vorgeschlagenen Methode (auf Teilen pro Milliarde). Daher wurde die Methode effizient für die gleichzeitige Analyse der beiden gleichzeitig verabreichten Arzneimittel im menschlichen Plasma eingesetzt.

Die Präzision und Richtigkeit der Methode wurde auch als Intra- und Inter-Day-Präzision durch die Analyse von drei verschiedenen Konzentrationen am selben Tag bzw. an drei aufeinanderfolgenden Tagen bewertet. Basierend auf den erhaltenen Ergebnissen wurde der % RSD berechnet, um die Präzision auszudrücken, während die mittlere prozentuale Wiederfindung jeder Nominalkonzentration (drei Wiederholungen) die Genauigkeit der Methode demonstrierte. Der niedrige %RSD zeigte die hervorragende Präzision der vorgeschlagenen Methode (Tabelle 2) und die große Wiederfindung zeigte ihre hohe Genauigkeit (Tabelle 3). Darüber hinaus wurde die Selektivität unserer Methode auch durch die gleichzeitige Schätzung der untersuchten Arzneimittel ohne gegenseitige Beeinflussung bewertet (Abb. 5). Die Fähigkeit der vorgeschlagenen Methode, beide Arzneimittel in dotiertem menschlichem Plasma mit niedrigem % RSD und ausgezeichneter Wiederfindung und ohne jegliche Beeinträchtigung durch die Plasmakomponenten zu analysieren, zeigte die hohe Selektivität der vorgeschlagenen Methode.

Synchrone Fluoreszenzspektren von: (A) (a) AGM (200,0 ng/ml), (b) Leerwert und (cj: 20,0, 50,0, 100,0, 200,0, 400,0, 600,0, 800,0, 1000,0 ng/ml VFX) bei Δλ = 20 nm, (B) (a) VFX (1000,0 ng/ml), (b) Leerwert und (cj: 5,0, 10,0, 20,0, 40,0, 60,0, 80,0, 100,0, 200,0 ng/ml AGM) bei Δλ = 20 nm.

Die vorgeschlagene Methode wurde verwendet, um synthetische Mischungen mit unterschiedlichen VFX- und AGM-Verhältnissen zu bewerten (Abb. S3, Zusatzmaterial). Die Konzentrationen beider Medikamente in verschiedenen Verhältnissen wurden mithilfe der jeweiligen Regressionsgleichungen geschätzt. Die erzielten Ergebnisse zeigten die Genauigkeit der Methode, wie in Tabelle S1, Zusatzmaterial, gezeigt.

Die optimierte Methode wurde zur Schätzung von VFX und AGM in ihren Einzeldosisformen angewendet. VFX wurde in seinen 75-mg-Kapseln analysiert, während AGM in seinen 25-mg-Tabletten bestimmt wurde. Die Methode zeigte hohe prozentuale Wiederfindungen (> 98 %) bei niedrigem % RSD (< 1,62) (Tabelle 4), was ihre hervorragende Anwendbarkeit für die Bestimmung von VFX und AGM in ihren Arzneimitteln ohne Beeinträchtigung durch die gemeinsam formulierten Hilfsstoffe bestätigt.

Die optimierte Methode wurde zur gleichzeitigen Analyse von VFX und AGM in menschlichem Plasma verwendet. AGM hat eine hohe Bioverfügbarkeit von über 78 % und wird nach oraler Verabreichung leicht resorbiert10. Die maximale Plasmakonzentration (Cmax) soll 15,1 ng/ml37 betragen. Darüber hinaus wurde berichtet, dass der therapeutische Plasmaspiegel von VFX im Bereich von 30–200 ng/ml38 liegt. Da diese Konzentrationen im linearen Bereich der etablierten Methode liegen, wird der Schluss gezogen, dass mit dieser Methode beide Arzneimittel gleichzeitig im menschlichen Plasma bestimmt werden können. Durch die grafische Darstellung des SFI gegenüber der Arzneimittelkonzentration in ng/ml wurde eine lineare Beziehung in Plasmaproben erzeugt, die mit VFX und AGM unter Verwendung der optimierten Methode versetzt wurden. Die folgenden Gleichungen wurden durch eine lineare Regressionsanalyse der Daten generiert:

Ein linearer Bereich wurde erhalten, indem Plasmaproben mit VFX und AGM in unterschiedlichen Konzentrationen im Bereich von 50,0 – 200,0 bzw. 5,0 – 15,0 ng/ml versetzt wurden. Die erzielten hohen prozentualen Wiederfindungen (> 97 %) zeigten die hohe Effizienz unserer Methode in derart komplexen Matrizen (Tabelle 5).

Die Entwicklung einer Vielzahl von Instrumenten und zugehörigen Messgrößen zur Bewertung der Umweltauswirkungen verschiedener Analyseverfahren ging den zunehmenden Bemühungen zur Entwicklung umweltfreundlicherer Analysetechniken voraus39. Obwohl jedes veröffentlichte Tool seine eigenen Berechnungen und Kriterien hat, könnten diese Tools und Metriken Chemikern den Weg zu umweltfreundlicheren Methoden weisen40. Daher könnte der gleichberechtigte Vergleich beider Wissenschaftlern dabei helfen, zu entscheiden, ob sie das eine oder das andere verwenden, abhängig von ihren Zielen und dem Grad der Präzision, den sie bei diesen Instrumenten anstreben39. In diesem Zusammenhang wollen wir die Umweltfreundlichkeit unserer vorgeschlagenen Methode anhand verschiedener Metriken bewerten, darunter den Green Analytical Procedure Index (GAPI)41 und Analytical GREEnness (AGREE)42.

Zur Evaluierung der gesamten Analysemethode wurde kürzlich die GAPI entwickelt. Es besteht aus fünf Pentagrammen, die Probenentnahme und -vorbereitung, Chemikalien und Lösungsmittel, Instrumente und Techniktyp darstellen. Die Verwendung der roten Farbe zeigt an, dass dieser Schritt möglicherweise umweltgefährdend ist, die gelbe Farbe zeigt an, dass dieser Schritt eine mäßige Auswirkung auf die Umwelt hat, und die grüne Farbe zeigt an, dass dieser Schritt umweltschonend ist. Von der schrittweisen Probenentnahme bis zur endgültigen Bestimmung wurde GAPI verwendet, um das grüne Potenzial der vorgeschlagenen Methode zu demonstrieren. Das GAPI-Piktogramm für das vorgeschlagene Verfahren ist in Abb. 6a dargestellt. Der einzige Nachteil ist der Vorbehandlungsschritt im Fall von Plasma, bei dem eine geringe Menge Methanol zur Proteinfällung verwendet wird. Darüber hinaus wurde AGREE, ein metrisches Tool, das den Schwerpunkt auf die Probenvorbereitung legt, zur Bewertung der Umweltverträglichkeit der neuen Methode verwendet. Es basiert auf 12 Wirkungskategorien, die dann auf einer Skala von 0 bis 1 in Teilkerne umgewandelt wurden und zur Erstellung des Endergebnisses der Bewertung herangezogen wurden. Zu den Bewertungsfaktoren gehörten Probengröße, Durchsatz, Abfallmenge, Energieverbrauch sowie die Auswahl und Verwendung von Lösungsmitteln, Materialien und Reagenzien. Bei der Bewertung wurde auch die Möglichkeit genutzt, die Relevanz von Kriterien durch Gewichtung zu unterscheiden. Die Ergebnisse der AGREE-Analyse sind in Abb. 6b dargestellt. Auf einer Skala von 0 bis 1 erhielt die AGREE-Analyse der untersuchten Verbindungen eine Gesamtbewertung von 0,78, was die ausgezeichnete Grünheit und die geringeren Umweltauswirkungen unseres Verfahrens bestätigt.

Bewertung des Umweltprofils der vorgeschlagenen Methode durch (a) GAPI, (b) AGREE.

Die erste synchrone fluoreszenzspektroskopische Methode wurde zur gleichzeitigen Bestimmung von Venlafaxin und Agomelatin entwickelt. Die Methode basiert auf der Verwendung von Wasser anstelle von giftigen oder gefährlichen Lösungsmitteln. Darüber hinaus verbesserte die Hinzufügung eines SDS-Mizellensystems die Empfindlichkeit der Methode erheblich. Die Methode wurde vollständig validiert und zeigte niedrige LODs in Teilen pro Milliarde. Folglich könnte die Methode zur therapeutischen Arzneimittelüberwachung in dotiertem menschlichem Plasma eingesetzt werden. Die Umweltverträglichkeit der Methode wurde mithilfe verschiedener metrischer Instrumente bewertet und bestätigte ihre hervorragende Umweltverträglichkeit und geringe Umweltbelastung. Die Vorteile der Methode sind: Sie ist einfach, leicht, umweltfreundlich, präzise und hochempfindlich. Die Vorteile der vorgeschlagenen Methode haben alle ihre Wirksamkeit und Eignung für den Einsatz in pharmazeutischen Qualitätskontrolllabors bewiesen.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Abteilung für pharmazeutische analytische Chemie, Fakultät für Pharmazie, Kafrelsheikh-Universität, Kafrelsheikh, 33511, Ägypten

Galal Magda

Abteilung für Pharmazeutische Analytische Chemie, Fakultät für Pharmazie, Mansoura-Universität, Mansoura, 35516, Ägypten

Fathalla Belal und Asmaa Kamal El-Deen

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GM: Konzeptualisierung, Methodik, formale Analyse, Validierung, schriftliche Überprüfung und Bearbeitung. FB: Konzeptualisierung, Ressourcen, Schreiben, Überprüfen und Bearbeiten, Untersuchung, Supervision. AKE: Konzeptualisierung, Datenkuration, Visualisierung, Schreiben – Originalentwurf. Alle Autoren haben das Manuskript zur Veröffentlichung freigegeben.

Korrespondenz mit Galal Magdy oder Asmaa Kamal El-Deen.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Magdy, G., Belal, F. & El-Deen, AK Green synchrone spektrofluorimetrische Methode zur gleichzeitigen Bestimmung von Agomelatin und Venlafaxin in menschlichem Plasma in Teilen pro Milliarde. Sci Rep 12, 22559 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26827-2

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Eingegangen: 11. September 2022

Angenommen: 20. Dezember 2022

Veröffentlicht: 29. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26827-2

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