Multifunktionales Metall

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 2688 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Eine gehemmte Immunantwort und niedrige Abgabemengen schränken die Wirksamkeit der Hungerkrebstherapie ein. Hier berichten wir über die gleichzeitige Abgabe von Glucoseoxidase (GOx) und Indoleamin-2,3-Dioxygenase (IDO)-Inhibitor 1-Methyltryptophan mithilfe eines Nanoreaktors auf der Basis von Metall-organischen Gerüsten (MOF), was eine verstärkte Freisetzung zur Tumoraushungerung zeigt. Oxidationsimmuntherapie. Das Nanosystem überwindet die mit der Tumorpenetration verbundenen Biobarrieren erheblich und verbessert die Bioverfügbarkeit der Ladung aufgrund der durch die schwach saure Tumormikroumgebung aktivierten Ladungsumkehr- und Größenreduzierungsstrategie. Das Nanosystem zerlegt sich schnell und setzt Ladungen als Reaktion auf die intrazellulären reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) frei. GOx verbraucht kompetitiv Glukose und erzeugt ROS, was die selbstverstärkende MOF-Zerlegung und Arzneimittelfreisetzung weiter induziert. Die durch Hunger/Oxidation kombinierte IDO-Blockade-Immuntherapie stärkt nicht nur die Immunantwort und stimuliert das Immungedächtnis durch die GOx-aktivierte Tumoraushungerung und Rekrutierung von Effektor-T-Zellen, sondern lindert auch effektiv die Immuntoleranz durch IDO-Blockade, wodurch das Tumorwachstum deutlich gehemmt wird und Metastasierung in vivo.

Die durch Glukoseoxidase (GOx) dargestellte Hungertherapie gilt als „grüne“ Strategie gegen Krebs, da sie die notwendige Nährstoffversorgung von Tumoren mit vernachlässigbaren Nebenwirkungen unterbricht1. GOx wurde aufgrund seiner Fähigkeit, immunstimulierende Wirkungen zu entfalten, zur Krebsaushungerungstherapie eingesetzt2,3,4. Es kann Tumore wirksam abtöten, indem es Glukose emulativ abbaut und zytotoxische reaktive Sauerstoffspezies (ROS) erzeugt, wodurch die Exposition tumorassoziierter Antigene (TAAs) für eine allgemeine Antitumorwirkung erleichtert wird5. Seine immunstimulierende Wirkung wird jedoch aufgrund verschiedener negativer Rückkopplungsmechanismen der Immunresistenz auf natürliche Weise gehemmt6. Die Blockade negativer Regulationswege in Kombination mit einer Hunger-/Oxidationstherapie stellt eine der vielversprechendsten Strategien für die Tumorimmuntherapie dar7.

Das Immun-Checkpoint-Protein Indoleamin-2,3-Dioxygenase (IDO) wird in Tumoren stark exprimiert und kann die Proliferation von Effektor-T-Zellen hemmen und die Expansion der regulatorischen T-Zellen (Treg) induzieren, indem es Tryptophan (Trp) zu Kynurenin (Kyn) katalysiert. und präsentiert sich damit als attraktives immuntherapeutisches Ziel zur Linderung der immunsuppressiven Mikroumgebung8,9. Die jüngsten Studien legen nahe, dass der IDO-spezifische kompetitive Inhibitor, also 1-Methyltryptophan (1-MT), die Immunumgehung wirksam lindern könnte10,11,12. Für die IDO-Blockade-Monotherapie wurde jedoch aufgrund unzureichender Antigenpräsentation und Immunantwort eine mäßige Krebsimmunität nachgewiesen13. Daher kann die Kombination der 1-MT-vermittelten IDO-Blockade-Immuntherapie und der GOx-aktivierten Hunger-/Oxidationstherapie eine praktikable Strategie gegen Tumoren mit starker Immunantwort und schwacher Immunresistenz sein.

Da die schlechte Bioverfügbarkeit und die schnelle Inaktivierung von GOx und sequenziellen biologischen Barrieren zu einer begrenzten Tumorpenetration und einer geringen Endozytose führen, ist der Aufbau multifunktionaler Nanosysteme für den effizienten Transfer von GOx und 1-MT in Tumoren von entscheidender Bedeutung, um die Wirksamkeit der Therapie zu verbessern14,15. Einerseits wurden Nanoreaktoren auf Basis metallorganischer Gerüste (MOFs), die die Vorteile von MOFs (z. B. hohe Beladungskapazität und gute Enzymtreue) und Nanoreaktoren (z. B. eingeschränkter Reaktionsraum für Enzyme) vereinen, als ideale Vehikel vorgeschlagen16,17 , aufgrund der effizienten gemeinsamen Abgabe der ungiftigen biologischen Enzyme (z. B. GOx) und 1-MT an Tumore. Somit führen die In-situ-Frachtfreisetzung und die Substratkatalyse (z. B. Glucose) zur Erzeugung toxischer Spezies (z. B. H2O2) mit verbesserter Bioverfügbarkeit und Therapiewirksamkeit. Andererseits kann die durch die Tumormikroumgebung aktivierte Strategie zur Größen-/Ladungsänderung diese biologischen Barrieren überwinden, was zu einer verbesserten Abgabeeffizienz und therapeutischen Wirkung führt18,19. Daher stellen die MOF-basierten Nanoreaktoren mit den Größen-/Ladungsänderungsmerkmalen ein geeignetes Nanosystem zur Verstärkung der Antitumor-Immunantwort durch kombinierte IDO-Blockade-Immuntherapie mit Hunger/Oxidation dar.

In dieser Arbeit wurde ein pH/ROS-doppelt empfindliches, abbaubares MOF-Nanoreaktor-basiertes Nanosystem (bezeichnet als PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT) mit selbstverstärkter Wirkstofffreisetzung und verbesserter Tumorpenetration zur gemeinsamen Abgabe von GOx konstruiert und 1-MT für die Tumoraushungerungs-/Oxidations-/IDO-Blockade-Immuntherapie. Im Vergleich zu früheren Studien weist das vorliegende Nanosystem die folgenden vier wichtigen Vorteile auf (Abb. 1): (1) Der tumoraktivierte abbaubare MOF-Nanoreaktor wird durch die kovalente Vernetzung mit den ROS-empfindlichen Wirkstoffen und Mn2+ synthetisiert, das schnell zerlegt werden kann durch die reichhaltige intrazelluläre ROS von Tumorzellen, wodurch die langfristige Retentionstoxizität der herkömmlichen MOFs minimiert wird; (2) Die im Nanoreaktor entwickelte Strategie zur Größen-/Ladungsänderung bricht nacheinander die Biobarrieren auf und verbessert die Abgabeeffizienz. Die Abschirmhülle des PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT-Nanosystems zeigt eine schnelle Entfernung der Polyethylenglykol (PEG)-Komponente, um als Reaktion auf die schwach saure Tumormikroumgebung (pH~) einen mit Polyethylenimin (PEI) konjugierten kationischen Kern zu bilden 6.8). Das transformierte Nanosystem mit stark positiver Ladung und geringer Größe verbessert die Tumorpenetrationstiefe und Endozytose deutlich; (3) Der Verbrauch von Glucose durch GOx geht mit der erhöhten Bildung von H2O2 einher, das durch eine Mn2+-vermittelte Fenton-ähnliche Reaktion mit hoher Toxizität weiter in Hydroxylradikale (·OH) umgewandelt werden kann, was zum vollständigen MOF-Abbau führt. Arzneimittelfreisetzung und verbesserte therapeutische Wirksamkeit; (4) Das PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT-Nanosystem nutzt die geförderte Immunantwort durch GOx-vermittelte Hunger-/Oxidationstherapie und die Unterdrückung der Immunresistenz durch IDO-Blockade-Immuntherapie und weist eine bemerkenswerte therapeutische Wirkung auf. Daher stellt die erfolgreiche Konstruktion des multifunktionalen PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT-Nanoreaktors ein Paradigma für die wirksame Überwindung der Biobarrieren bei der Abgabe dar und zeigt eine überlegene Tumortötungswirksamkeit durch Hungertherapie zusammen mit immunmodulatorischen Effekten auf.

Syntheseweg und schematische Darstellung des PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT-Nanosystems für die kombinierte Hunger-, Oxidations- und Immuntherapie.

Um ein auf ROS reagierendes Mn-basiertes MOF (Mn-DTA) zu konstruieren, wurde eine ROS-empfindliche Verbindung 1 (Linker) synthetisiert (siehe Abschnitt „Methoden“ und ergänzende experimentelle Details), was durch 1H-NMR und Massenspektrometrie bestätigt wurde (Abb. 2a, b). Anschließend wurde Mn-DTA über die hydrothermale Reaktion synthetisiert. Die starken Beugungspeaks für die Ebenen 100°, 002°, 101°, 102°, 110°, 103° und 112° werden im Pulverröntgenbeugungsmuster (XRD) (Abb. 2c) beobachtet, was mit der Kristallstruktur übereinstimmt von MnS20,21. Darüber hinaus zeigten die auf der CCDC-Datenbank berechneten Ergebnisse, dass Mn2+ tatsächlich mit drei Liganden der Verbindung 1 koordiniert, um eine regelmäßige hexagonale Prismenstruktur zu bilden (Abb. 2d–f). Insbesondere besetzen drei Mn2+-Ionen die drei Eckpunkte des Sechsecks und zwei Mn2+-Ionen befinden sich an den beiden Eckpunkten des Vierecks in jedem hexagonalen Prisma, während der Linker zwischen Mn2+ und –COOH aus Verbindung 1 die Seiten des hexagonalen Prismas bildet. Inzwischen wird jedes Mn2+ von zwei benachbarten Vierecken und einem Sechseck geteilt (Abb. 2g). Diese Ergebnisse zeigten insgesamt, dass Mn-DTA eine dreidimensionale poröse Netzwerkstruktur besaß20.

a 1H-NMR- und (b) ESI-MS-Spektren von Verbindung 1. c Pulver-XRD-Muster von Mn-DTA (MnS, JCPDS Nr. 89-4089). d Elementarzellenstruktur und (e, f) Kristallstruktur (3 × 3 x 3) von MnS, berechnet anhand der CCDC-Datenbank (ICSD-Eintrag: 44765). g Schematische Darstellung der Kristallmorphologie von Mn-DTA-MOF. Die violetten und gelben Gelenke repräsentieren Mn- bzw. S-Atome.

Die morphologische Struktur von Mn-DTA wurde durch Transmissions-/Rasterelektronenmikroskopie (TEM/SEM) nachgewiesen. Wie in Abb. 3a und der ergänzenden Abb. 1a gezeigt, weist Mn-DTA eine kugelförmige Struktur mit einer Größe von ~ 50 nm auf, die sich positiv auf die Überwindung von Biobarrieren mit hohem interstitiellen Druck und dichter extrazellulärer Tumormatrix auswirkt und zu einer besseren Tumorpenetration führt eine verbesserte Liefereffizienz22,23. Die Struktur von Mn-DTA wurde durch energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDS)-Elementarkartierungen von Mn, S und O (Abb. 3b) weiter verifiziert, die aus MnCl2 und Verbindung 1 stammen. Bemerkenswerterweise weist Mn-DTA die Gitterabstände auf von 0,305 und 0,328 nm, nachgewiesen durch HRTEM (ergänzende Abbildung 1b), die mit den durch XRD bestimmten Werten für die (101, 002)-Ebenen von MnS übereinstimmen. Die Brunauer-Emmett-Teller (BET)-Analyse von Mn-DTA ergab eine typische Typ-IV-Isotherme (ergänzende Abbildung 2), was auf eine ausgeprägte mesoporöse Struktur schließen lässt. Darüber hinaus betrugen die Oberfläche, die durchschnittliche Adsorptionsporengröße und das Zetapotential von Mn-DTA 107,8 m2 g−1, 8,61 nm und −54 mV (Ergänzungsabbildung 3 bzw. Ergänzungstabelle 1). Die Ergebnisse bestätigten, dass der Mn-DTA-Kern mit geeigneter Größe erfolgreich synthetisiert wurde.

ein TEM-Bild und (b) EDS-Elementkartierungen von Mn-DTA. c TEM-Bild von PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT. d DLS-Kurven von Mn-DTA und PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT nach entsprechender Behandlung bei pH 7,4 oder 6,8 mit oder ohne H2O2 für 4 Stunden. e Absorptionsspektren von GOx, 1-MT und PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT, inkubiert mit verschiedenen Konzentrationen von H2O2 oder Glucose für 12 Stunden. f, g TEM-Bilder von Mn-DTA (f) und PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT (g), behandelt mit H2O2 für 4 Stunden. Maßstabsbalken: 50 nm für a, b und f, 100 nm für c und g.

Anschließend wurde PCP-Mn-DTA durch Konjugation der Verbindung 3 als Schale auf der Oberfläche des Mn-DTA-Kerns konstruiert. Verbindung 3 wurde wie zuvor berichtet19 erfolgreich synthetisiert und durch 1H-NMR-Spektroskopie, Gelpermeationschromatographie (GPC) und Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR) bestätigt (Ergänzungsabbildungen 4, 5 und Ergänzungstabelle 2). Nach der Funktionalisierung mit der Schale und der gleichzeitigen Beladung mit GOx und 1-MT zeigte das erhaltene PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT eine ähnliche Morphologie wie der Mn-DTA-Kern. Allerdings existierte eine offensichtliche äußere Schicht um Mn-DTA und die Gesamtstruktur von PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT wurde verschwommen (Abb. 3c). Darüber hinaus erhöhte sich der Durchmesser von 49,5 ± 7,3 auf 97,0 ± 4,5 nm (n = 300), was durch dynamische Lichtstreuung (DLS, Abb. 3d) bestätigt wurde. Darüber hinaus stieg das Oberflächenpotential von –54 mV auf –13,7 mV (ergänzende Abbildung 3). Bemerkenswerterweise zeigte das Absorptionsspektrum von PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT die charakteristischen Peaks von GOx und 1-MT (Abb. 3e), was auf eine erfolgreiche Wirkstoffbeladung schließen lässt. Die Beladungsgehalte von GOx und 1-MT betrugen 8,8 % bzw. 13,5 % (ergänzende Abbildung 6). Darüber hinaus wies das Nanosystem eine wirksame Biostabilität auf, was durch die Beibehaltung der Größe nach 6-tägiger Inkubation mit 10 % Serum angezeigt wird (ergänzende Abbildung 7), was für die Arzneimittelabgabe in vivo förderlich ist.

Die wesentlichen Merkmale des PCP-Mn-DTA-Nanosystems waren die pH-empfindliche Größenverringerung, Ladungsumwandlung, ROS-aktivierter selbstverstärkter Abbau und Ladungsfreisetzung, die zur Verbesserung der Tumorpenetration und Zellaufnahme24 sowie zur Erzielung einer vollständigen Wirkstofffreisetzung erforderlich sind. Bereitstellung von ROS für die Abtötung von Tumoren usw. Die pH-abhängige Ladungsumkehr und Größenverringerung des Nanosystems wurde durch TEM, DLS und Zetapotential charakterisiert. Nach der Inkubation mit pH 6,8 (Simulation der Tumormikroumgebung) verringerte sich die durchschnittliche Größe von PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT dramatisch auf etwa 55 nm (Abb. 3d), was nahe an der Größe von nativem Mn-DTA lag , aufgrund der Entfernung der PEG-Hülle19. In der Zwischenzeit kehrte sich das Oberflächenpotential entsprechend von –13, 7 mV auf + 34, 2 mV um (ergänzende Abbildung 3), was die pH-empfindliche Ladungsumkehr bestätigt.

Das auf ROS reagierende selbstverstärkte Zerlegungs- und Arzneimittelfreisetzungsverhalten des Nanosystems wurde durch TEM-, DLS- und UV-Vis-Spektroskopie verifiziert. Wie in Abb. 3f, g gezeigt, kollabierte die natürliche sphärische Struktur von Mn-DTA und PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT bei Einwirkung von H2O2, was mit DLS übereinstimmte (Abb. 3d), was auf die ROS schließen lässt -Responsive Demontage. Darüber hinaus zeigten die UV-Vis-Spektren von PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT, dass die charakteristische Peakintensität von GOx und 1-MT mit zunehmender H2O2-Konzentration zunahm (Abb. 3e), was auf die Reaktion auf ROS hinweist Arzneimittelfreisetzung. Bemerkenswert ist, dass nach der Exposition gegenüber Glukose die Absorptionsspitzenintensität von GOx und 1-MT im Nanosystem aufgrund der GOx-katalysierten ROS-Selbsterzeugung und selbstverstärkten Arzneimittelfreisetzung stark erhöht war.

Um das ROS-empfindliche Arzneimittelfreisetzungsverhalten weiter zu beweisen, wurde gleichzeitig der Echtzeit-Freisetzungstest durchgeführt. In der Kontrollgruppe wurde unter physiologischen Bedingungen (pH 7,4) über 24 Stunden eine vernachlässigbare GOx-Freisetzung (unter 16 %) beobachtet (Abb. 4a), was auf die gute Stabilität des Nanosystems schließen lässt. Im Gegensatz dazu wurden etwa 58 % bzw. 79 % GOx aus PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT bei Inkubation mit 0,1 bzw. 1 mM H2O2 freigesetzt, was die ROS-responsive Arzneimittelfreisetzung bestätigt. Nach der Interaktion mit Glucose zeigte PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT eine hohe GOx-Freisetzung (~81 % und 90 %), was auf die Selbsterzeugung von ROS und die durch GOx ausgelöste kaskadenverstärkte Arzneimittelfreisetzung zurückzuführen ist. Es war erwähnenswert, dass PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT eine ausreichende Wirkstofffreisetzung zeigte, wenn es der biologisch relevanten Glukose- und intratumoralen ROS-Konzentration (0,1 mM H2O2, Abb. 4a)25 ausgesetzt wurde. Diese Eigenschaft kann möglicherweise die durch die unzureichende endogene ROS-Konzentration verursachte unvollständige Arzneimittelfreisetzungsbeschränkung überwinden und so die Effizienz der Tumorabtötung verbessern.

a Kumulative Freisetzung von GOx aus PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT nach Behandlungen mit unterschiedlichen Konzentrationen von H2O2 oder H2O2 plus Glucose (abgekürzt als Glu). b, c pH-Werte und erzeugte H2O2-Konzentrationen zu verschiedenen Zeitpunkten, entstanden aus der durch GOx (b) und PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT (c) katalysierten Zerfallsreaktion von Glucose. d CLSM-Bilder und (e) quantitative Messungen der intrazellulären ROS. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD dar (n = 4 unabhängige Proben). Die P-Werte wurden durch den ungepaarten Student-t-Test (zweiseitig) bestimmt, **p < 0,01. Maßstabsbalken: 50 μm.

Um die katalytische Aktivität der GOx- und ROS-Selbsterzeugungskapazität des Nanosystems aufzudecken, wurden der Enzymaktivitätstest und die auf ROS-Sonden basierende konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) eingesetzt26. Typischerweise wurden freies GOx und PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT mit Glucose inkubiert, um die GOx-Aktivität zu bewerten, die sich in der pH-Änderung (induziert durch Gluconsäure) und der H2O2-Erzeugung widerspiegelte. Wie in Abb. 4b, c dargestellt, sanken die pH-Werte allmählich und die H2O2-Erzeugung nahm zusammen mit der Dauer der katalytischen Reaktion sowohl in den GOx- als auch in den PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT-Gruppen zu. Die Senkung des pH-Werts und die Bildung von H2O2 in PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT erreichten innerhalb von 1 Stunde schnell ein Gleichgewicht, und ein ähnlicher Trend wurde auch bei freiem GOx beobachtet. Diese Ergebnisse bestätigten eine hohe katalytische Aktivität des PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT-Nanosystems, die durch die MOF-Einkapselung nicht beeinträchtigt wurde. Im Vergleich zur Kontroll- und PCP-Mn-DTA-negativen Gruppe erzeugten sowohl die PCP-Mn-DTA@GOx- als auch die PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT-Gruppe effektiv ROS, wie die grüne Fluoreszenz und die damit verbundene quantitative Analyse zeigen (Abb . 4d, e). Die Menge der ROS-Erzeugung durch PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT nahm in Abwesenheit von Glucose drastisch ab (p < 0,01). Die Ergebnisse bestätigten, dass das PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT-Nanosystem eine effiziente Arzneimittelfreisetzung erreichen konnte und dass die vom Nanosystem erzeugten ROS tatsächlich glukoseabhängig waren.

Der CCK8-Assay wurde verwendet, um die In-vitro-Zytotoxizität des PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT-Nanosystems gegenüber B16F10-Zellen zu bewerten. Im Vergleich zur Kontrolle zeigte PCP-Mn-DTA unabhängig von der Inkubationszeit eine vernachlässigbare Zytotoxizität bei Dosierungen (50–1000 μg mL-1) (ergänzende Abbildung 8), was auf eine optimale Kompatibilität des PCP-Mn-DTA-Nanoträgers schließen lässt. Darüber hinaus verursachte freies 1-MT aufgrund seiner schwachen Toxizität spezifische Zellschäden (Abb. 5a). Unterdessen zeigte sich für PCP-Mn-DTA@1-MT im Vergleich zu freiem 1-MT eine relativ geringe Zelllebensfähigkeit, was auf die hervorragende Effizienz der Arzneimittelabgabe zurückzuführen ist. Nach der Beladung mit GOx führte PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT zu einer schwerwiegenderen Zellschädigung, die auf den GOx-induzierten Hunger-/Oxidationsschaden zurückzuführen ist28,29. Darüber hinaus trat die niedrigste Zelllebensfähigkeit bei PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT plus Glucose 48 Stunden nach der Inkubation auf. Die Ergebnisse zeigten, dass das Nanosystem die Tumorzellen durch GOx-katalysierte ROS-Erzeugung wirksam abtötete (Abb. 4d, e) und dass die Zugabe von Glucose den B16F10-Zelltod durch GOx-Katalyse weiter förderte.

a Zytotoxizitätsstudien von B16F10-Zellen, die mit PCP-Mn-DTA, 1-MT, PCP-Mn-DTA@1-MT und PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT mit oder ohne Glucose für 24 und 48 Stunden kultiviert wurden , jeweils. b Tumorpenetration und (c) Endozytosebilder von PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT, markiert mit FITC in B16F10 MCSs nach jeweiliger Inkubation bei pH 6,8 oder 7,4 für 4 und 12 Stunden, mit Bildern, die repräsentativ für 3 Experimente sind. Kerne und Zytoskelett wurden jeweils mit DAPI (blau) und ActinRed™555 (rot) gefärbt. d Quantitative FCM-Analyse basierend auf (c). Die Daten stellen den Mittelwert ± SD dar (n = 6 biologisch unabhängige Proben). Die P-Werte wurden durch den ungepaarten Student-t-Test (zweiseitig) bestimmt, **p < 0,01. Maßstabsbalken: 100 µm für b, 50 µm für c.

Die auf B16F10-Zellen basierenden mehrzelligen Sphäroide (MCSs) wurden zur Bewertung der Tumorinfiltrationseigenschaft des Nanosystems19 konstruiert. Zu diesem Zweck wurden GOx und PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) markiert und CLSM wurde verwendet, um die Penetration des Nanosystems zu überwachen. Wie in Abb. 5b gezeigt, war PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT nach 4 Stunden nach der Inkubation bei pH 7,4 um die äußere Grenze von MCS verteilt, und nur ein kleiner Anteil von PCP-Mn-DTA@GOx@ 1-MT gelangte nach 12-stündiger Inkubation in MCSs, was auf eine eingeschränkte Penetration von PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT aufgrund der relativ großen Größe hinweist. Interessanterweise war die von PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT emittierte grüne Fluoreszenz nach 4-stündiger Inkubation bei pH 6,8 weit über das gesamte MCS verteilt, was auf eine gute Tumorpenetration hindeutet. Darüber hinaus nahm die Penetrationstendenz mit der Verlängerung der Inkubationsdauer auf 12 Stunden weiter zu, was sich in einer deutlich stärkeren grünen Fluoreszenz zeigte. Die quantitative Analyse bestätigte die pH-verstärkte Tumorpenetration des Nanosystems (ergänzende Abbildung 9) aufgrund der Größenverringerung und Ladungsumwandlung als Reaktion auf die schwach saure Tumormikroumgebung. Die Ergebnisse zeigten insgesamt, dass das PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT-Nanosystem über eine günstige Fähigkeit zur Tumorpenetration verfügt, was zur Überwindung von Biobarrieren und zur Verbesserung der Effizienz der Arzneimittelabgabe beiträgt.

Anschließend wurde die zelluläre Aufnahme des Nanosystems in die B16F10-Zellen mittels Durchflusszytometrie (FCM) und CLSM untersucht. Im Vergleich zur Kontrolle zeigte die Aufnahme von PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT durch die B16F10-Zellen ein zeitabhängiges Verhalten und die Endozytosemenge von PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT war deutlich höher als freies GOx bei pH 7,4 oder pH 6,8 (Abb. 5c, d), was wiederum auf die überlegene Abgabewirkung des PCP-Mn-DTA-Nanoträgers hinweist. Darüber hinaus war die endozytierte Population bei pH 6,8 viel höher als bei pH 7,4, unabhängig von der Inkubationszeit. Dieses Phänomen ist darauf zurückzuführen, dass die Größen- und Ladungsumwandlung des Nanosystems bei niedrigem pH-Wert die Endozytoseeffizienz erhöht. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Größenverringerung und Ladungsumwandlung des durch die schwach saure Tumormikroumgebung aktivierten Nanosystems die Tumorinfiltration und Zellaufnahme deutlich steigern könnte, was für die Abtötung von Tumoren hilfreich ist30,31.

Um die hemmende Wirkung des Nanosystems auf die IDO-Enzymaktivität in vitro zu untersuchen, wurde die Expression von IDO in den mit PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT behandelten B16F10-Zellen mittels Western Blot gemessen. Verglichen mit der Kontrollgruppe (PBS) und der PCP-Mn-DTA-negativen Gruppe zeigte 1-MT eine offensichtliche Hemmung der IDO-Expression (Abb. 6a)32. Darüber hinaus hemmten sowohl PCP-Mn-DTA@1-MT als auch PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT die Herunterregulierung der IDO-Expression im Vergleich zu freiem 1-MT (p <0,01, Abb. 6b) signifikanter, was darauf hindeutet dass die Unterdrückung der IDO-Aktivität von der verbesserten Abgabeeffizienz des Nanosystems profitierte10.

a, b Wirkung von PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT auf die IDO-Expression nach der Behandlung, nachgewiesen durch Western Blot (a) und quantitative Analyse (b). c FCM-Ergebnisse und (d) quantitative Analyse des EdU+-T-Zellanteils, der mit B16F10-Zellen kokultiviert wurde, nach den Behandlungen mit PBS, PCP-Mn-DTA, 1-MT, PCP-Mn-DTA@1-MT und PCP-Mn-DTA @GOx@1-MT bzw. e Schematische Darstellung des PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT-Nanosystems zum Hemmmechanismus von IDO1 in Tumorzellen. Die angezeigten Daten sind Mittelwert ± SD und repräsentativ für 4 (a, b) oder 6 (c, d) unabhängige Experimente. Die P-Werte wurden durch den ungepaarten Student-t-Test (zweiseitig) bestimmt, **p < 0,01.

Um den durch das PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT-Nanosystem vermittelten IDO-Hemmeffekt auf die T-Zell-Proliferation aufzudecken, wurde ein In-vitro-Co-Kulturmodell bestehend aus B16F10-Zellen und Lymphozyten konstruiert, um die Proliferation zu untersuchen33. Wie in Abb. 6c gezeigt, war der Anteil der EdU+ T-Zellen im Vergleich zur Kontrolle (PBS) nach Behandlung mit 1-MT- und 1-MT-beladenen Formulierungen (PCP-Mn-DTA@1-MT und PCP- Mn-DTA@GOx@1-MT), was auf eine verbesserte T-Zell-Proliferation schließen lässt. Darüber hinaus war die Menge der proliferierten T-Zellen in PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT größer als in der 1-MT-Gruppe (Abb. 6d), was die hervorragende Abgabeeffizienz des Nanosystems erneut bestätigt. Die Phänomene lassen sich wie folgt erklären (Abb. 6e): Erstens sind die Aufnahmeeffizienz und Bioverfügbarkeit von freiem 1-MT durch seine schlechte Löslichkeit begrenzt. Im Gegensatz dazu kann PCP-Mn-DTA mit einer hohen Wirkstoffbeladungskapazität die schlechte Löslichkeit von 1-MT wirksam überwinden und die Bioverfügbarkeit des Wirkstoffs verbessern. Zweitens kann PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT von den B16F10-Zellen effektiv endozytiert werden, um 1-MT und GOx als Reaktion auf die intrazellulären ROS und zusätzliche durch GOx erzeugte ROS freizusetzen. Somit könnte eine große Menge an 1-MT IDO signifikant hemmen und die T-Zellaktivität wiederherstellen. Diese Ergebnisse bestätigen das erhebliche Potenzial des Nanosystems zur Verbesserung der Antitumorimmunität in vivo.

Die lysosomale Fluchtfähigkeit des PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT-Nanosystems ist für die Aufrechterhaltung der Bioaktivität von GOx und das Erreichen der gewünschten Tumorschädigung von entscheidender Bedeutung. CLSM wurde verwendet, um das lysosomale Entweichen des Nanosystems zu überwachen, das aus dem Grad der Übereinstimmung zwischen der grünen Fluoreszenz (FITC-markiertes Nanosystem) und der roten Fluoreszenz (rot markierte Lysosomen mit Lysotracker) bestimmt wurde34. Bei der einstündigen Inkubation der B16F10-Zellen mit PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT wurde festgestellt, dass die mit PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT markierte grüne Fluoreszenz weitgehend am Rand der Zellmembran verteilt war ( Abb. 7a), die ein natürliches Zeichen für Endozytose zeigt. Da die Inkubationsdauer auf 3 Stunden verlängert wurde, war fast das gesamte PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT in den Lysosomen lokalisiert, wie die gut passende hellgelbe Fluoreszenz zeigt. Darüber hinaus wurde die mit PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT markierte grüne Fluoreszenz von den Lysosomen auf das Zytoplasma übertragen, als die Inkubationsdauer auf 8 Stunden verlängert wurde, was auf eine erfolgreiche Lysosomenflucht hinweist. Das PEI-funktionalisierte Nanosystem könnte die Zerstörung der lysosomalen Membran durch die inhärente Protonierung von PEI induzieren35,36, was zum Entweichen der Lysosomen sowie zur zytoplasmatischen Freisetzung von GOx und 1-MT zur Abtötung der Tumorzellen führt.

a B16F10-Zellen, die mit FITC-markiertem PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT für verschiedene Zeiten inkubiert wurden, gefolgt von einer Färbung mit Lysotracker-Rot, um den Lysosomenaustritt abzubilden, mit Bildern, die für drei Experimente repräsentativ sind. b, c FCM und quantitative Apoptoseanalyse von B16F10-Zellen nach 24-stündiger Differenzbehandlung. d–f Apoptose-assoziierte Proteine ​​in B16F10-Zellen nach der Behandlung mit den angegebenen Systemen, untersucht durch Western Blot (d) und die damit verbundene quantitative Analyse von Bax/Bcl-2 (e) und Cytochrom C (f). g–i Mikroskopiebilder (g) und quantitative Analyse der Wundheilung und -migration (h) sowie Invasionstests (i) von B16F10-Zellen nach der Behandlung mit diesen Systemen. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD dar (n = 4 biologisch unabhängige Proben). Die P-Werte wurden durch den ungepaarten Student-t-Test (zweiseitig) bestimmt, **p < 0,01. Maßstabsbalken: 20 μm für a, 100 μm für g.

Anschließend wurden FCM und CLSM eingesetzt, um das Apoptose/Tod-Verhältnis der mit den verschiedenen Proben inkubierten B16F10-Zellen unter Verwendung von Annexin V-FITC/PI (PI: Propidiumiodid) und Lebend-Tot-Färbekits genau zu überwachen. Wie in Abb. 7b gezeigt, wurde im Vergleich zur Kontrolle ein geringer Grad an Apoptose und Todesrate (6,58 %) beim leeren Vehikel PCP-Mn-DTA nach 24-stündiger Inkubation beobachtet, was auf eine überlegene Kompatibilität schließen lässt. Freies 1-MT verursachte dank der natürlichen Zytotoxizität von PCP-Mn-DTA@1-MT einen moderaten Grad an Apoptose, der offensichtlich niedriger war als der von PCP-Mn-DTA@1-MT (12,91 % vs. 21,7 %, p < 0,01, Abb. 7c). 1-MT37 und der Liefereffekt des Nanosystems. PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT führte zu einer schweren Apoptose (47,4 %), die auf den durch GOx verursachten Hunger-/Oxidationsschaden zurückzuführen war. Es wurde eine offensichtliche H2O2-Erzeugung und Hemmung der ATP-Produktion durch die GOx-beladenen Systeme (PCP-Mn-DTA@GOx und PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT, ergänzende Abbildung 10) beobachtet. Darüber hinaus erzeugte PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT plus Glucose bei allen Behandlungen das höchste Apoptoseverhältnis (54,1 %), und der Lebend-Tot-Assay spiegelte auch die ähnliche Tendenz zur Tumortötung wider (ergänzende Abbildung 11). Die oben genannten Ergebnisse bestätigten umfassend die überlegene Tumortötungseffizienz des Nanosystems.

Um den durch das PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT-Nanosystem induzierten Apoptosemechanismus weiter zu veranschaulichen, wurde der Western-Blot-Assay verwendet, um die Expression der verwandten Apoptoseproteine, einschließlich Bax, Bcl-2 und Cyt-C, zu bewerten. Wie in Abb. 7d gezeigt, wurde in der freien 1-MT-Gruppe im Vergleich zur Kontrolle eine leichte Hochregulierung des Bax/Bcl-2-Verhältnisses und des Cyt-C beobachtet, während PCP-Mn-DTA@1-MT eine deutlichere Expression induzierte Tendenz als die von 1-MT, was die anfängliche Zytotoxizität von 1-MT und die intensive Abgabeeffizienz des Nanosystems bestätigt. Darüber hinaus führte PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT zu einer auffälligen Hochregulierung von Bax und Cyt-C sowie einer Herunterregulierung von Bcl-2, was auf die kombinierte Wirkung des GOx-vermittelten Hunger-/Oxidationsschadens und 1 zurückzuführen ist -MT-verursachte Zytotoxizität. PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT plus Glucose induzierte die höchste Hochregulierung der Bax/Bcl-2- und Cyt-C-Expression in allen Gruppen (Abb. 7e, f), was auf die überlegene Antitumorwirkung von PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT hinweist. Mn-DTA@GOx@1-MT.

Da der durch GOx und 1-MT regulierte Energiestoffwechsel eng mit der Tumormigration zusammenhängt38,39, wurde der Grad der Antimigration von PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT anhand der Wundheilung, Tumormigration und -invasion bewertet Studien. Wie in Abb. 7g gezeigt, zeigten die Kontroll- und PCP-Mn-DTA-Gruppen ein starkes Heilungsverhalten, das sich im Verschwinden der Kratzer widerspiegelte. Es deutete darauf hin, dass die B16F10-Zellen inhärente metastatische Eigenschaften aufwiesen. 1-MT und PCP-Mn-DTA@1-MT zeigten eine mäßige Antimigrationswirkung mit Heilungsraten von 75 % bzw. 58 % (ergänzende Abbildung 12). Die PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT-Gruppe induzierte die niedrigste Heilungsrate von 39 %, was auf die wirksamste Hemmung der Zellmotilität hinweist. Darüber hinaus zeigte PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT auch die stärkste Migrations- und Invasionsunterdrückung mit Abdeckungsraten von 30,1 % bzw. 24,9 % (p < 0,01, Abb. 7h, i), wie der Ausdruck weiter zeigt und quantitative Analyse der mit der Tumorinvasion assoziierten Proteine ​​(E-Cadherin, MMP2 und MMP9, ergänzende Abbildung 13). Infolgedessen wurde in vitro aufgrund der kombinierten Wirkung von GOx-vermitteltem Hunger-/Oxidationsschaden, 1-MT-verursachter Zytotoxizität und Immunregulation eine hohe Antitumor- und Antimetastasierungswirkung erzielt, die durch die anschließende In-vivo-Immunregulierung weiter unterstützt wurde Reaktionstests.

Um die Antitumor-Immunantwort des PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT-Nanosystems zu validieren, wurden die relevanten Immun-T-Zellen an den Tumorstellen durch FCM in den tumortragenden B16F10- und 4T1-Mäusen quantitativ analysiert. Wie in Abb. 8a – d und den ergänzenden Abbildungen gezeigt. 14 und 15 wurden in der Kontrollgruppe eine große Menge an Treg-Zellen und eine geringe Menge an tumorinfiltrierenden zytotoxischen T-Zellen (CTLs) beobachtet, was auf die angeborene Immunresistenz zurückzuführen ist. Unterdessen zeigte die Menge an CTLs in der freien 1-MT-Gruppe einen moderaten Anstieg, während die Treg-Zellen einen leichten Rückgang zeigten. PCP-Mn-DTA@1-MT zeigte eine überlegene Tendenz als freies 1-MT, was auf die erleichterte Unterdrückung der Effektor-T-Zellaktivität und die Hemmung der Treg-Zellproliferation durch IDO-Blockierung40,41 sowie auf eine hohe Effizienz der Arzneimittelabgabe zurückzuführen ist. Bemerkenswerterweise induzierte PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT unabhängig von den tumortragenden Mausmodellen B16F10 und 4T1 das höchste Ausmaß an tumorinfiltrierenden CTLs und die geringste Menge an Treg-Zellen (p < 0,01, Abb. 8b, d). , was auf eine verstärkte Aktivierung der Immunantwort bei unterdrückter Immunevasion hinweist. Bemerkenswerterweise nahm der Anteil der CD4+-Helfer-T-Zellen in den freien 1-MT- und 1-MT-beladenen Gruppen bei den B16F10-tumortragenden Mäusen ab (ergänzende Abbildung 16), was mit den zuvor berichteten Studien übereinstimmt9,42.

a, c FCM und (b, d) quantitative Analyse der Populationen tumorinfiltrierender zytotoxischer CD8+-T-Zellen, Treg-Zellen, NK-Zellen, dendritischer Zellen und B-Zellen aus den B16F10-tumortragenden C57BL/6-Mäusen und 4T1-Tumor- tragende Balb/c-Mäuse jeweils 4 Tage nach der Verabreichung. e Veränderungen des Kyn/Trp-Verhältnisses des B16F10-Tumormodells nach der oben genannten Behandlung über 4 Tage. f IFC-Bilder von Tumorschnitten, die mit Anti-IDO, Anti-mTOR und Anti-STAT3 gefärbt wurden, mit Bildern, die für drei Experimente repräsentativ sind. Maßstabsleiste: 100 µm. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD dar (n = 6 biologisch unabhängige Proben). Die P-Werte wurden durch den ungepaarten Student-t-Test (zweiseitig) bestimmt, **p < 0,01.

IDO1 kann den Metabolismus von Trp zu Kyn katalysieren und so zur direkten Hemmung des Säugetierziels von Rapamycin (mTOR) und zur Aktivierung der Signalwandler/Aktivatoren der Transkription (STAT3) über den AHR-IL-6-STAT3-Weg43 führen. 44,45. Das Verhältnis von Kyn zu Trp, die Expression von intratumoralem IDO1, mTOR und STAT3 können als Indikatoren dienen, um den gelinderten Immunresistenzmechanismus des PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT-Nanosystems aufzudecken. Wie in Abb. 8e, f gezeigt, hemmten sowohl PCP-Mn-DTA@1-MT als auch PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT wirksam die IDO-Expression, was sich auch im niedrigsten Verhältnis von intratumoralem Kyn zu Trp zeigt als eine signifikante Herunterregulierung von IDO1. Darüber hinaus wurde in den Gruppen PCP-Mn-DTA@1-MT und PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT eine offensichtliche Hochregulierung von mTOR und eine Herunterregulierung von STAT3 beobachtet, was darauf hindeutet, dass das 1-MT-Nanosystem effektiv geladen ist blockierte die IDO1-vermittelte Immunresistenz und verstärkte die Immunantwort.

Da die wirksame Abtötung von Tumorzellen positiv mit der Menge der reifen dendritischen Zellen sowie der Verstärkung der Aktivierung der Immunantwort durch die Exposition von TAAs und die Präsentation des „Iss mich“-Signals46 zusammenhängt, wurde die Proliferation der reifen dendritischen Zellen weiter untersucht veranschaulichen den Mechanismus des Nanosystems zur Stärkung der Immunantwort. Wie in Abb. 8b, d und der ergänzenden Abb. 17 gezeigt, förderten 1-MT, PCP-Mn-DTA@1-MT und PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT die Reifung dendritischer Zellen mit der Sequenz 1- MT < PCP-Mn-DTA@1-MT < PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT, was die effektive Rekrutierung der dendritischen Zellen bestätigt. Aufregenderweise zeigte PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT auch die höchste Rekrutierung der intratumoralen NK- und B-Zellen in B16F10- oder 4T1-tumortragenden Mäusen (p <0,01, Abb. 8b, d und ergänzende Abb. 18). und 19). Es könnte vermutet werden, dass PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT die Tumorschädigung über die GOx-vermittelte Hunger-/Oxidationstherapie wirksam induzieren könnte (Abb. 5a und Abb. 7b – f). Somit verstärkten die erhöhte Tumorimmunogenität und die Exposition gegenüber TAAs die intratumorale Rekrutierung der Effektor-T-Zellen erheblich, und die durch 1-MT initiierte Unterdrückung der Immunresistenz (Abb. 6 und 8b, d) verstärkte die gesamte Antitumor-Immunantwort weiter. Durch die Nutzung der GOx-ausgelösten Hunger-/Oxidationstherapie und der 1-MT-vermittelten IDO-Blockade-Immuntherapie stärkte das PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT-Nanosystem effektiv die systemische Antitumor-Immunantwort.

Um den Vorteil der kombinierten Hunger-/Oxidationstherapie und der IDO-Blockade-Immuntherapie zu bestätigen, wurde die Antitumorbewertung gleichzeitig in vivo sowohl in B16F10- als auch in 4T1-tumortragenden Mausmodellen durchgeführt. In diesen Modellen zeigte die PCP-Mn-DTA-Gruppe ein schnelles Tumorwachstum ähnlich der Kontrolle (Abb. 9a, a'), was auf die vernachlässigbare Antitumorwirkung des leeren Trägers hinweist. Darüber hinaus zeigten die Gruppen mit freiem 1-MT und PCP-Mn-DTA@1-MT eine leichte und mäßige Hemmung des Tumorwachstums, was auf die individuelle Immuntherapie und die verbesserte Abgabeeffizienz zurückzuführen ist. Noch wichtiger ist, dass die PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT-Gruppe die offensichtlichste Hemmung des Tumorwachstums ohne signifikanten Verlust des Körpergewichts hervorrief (ergänzende Abbildung 20), was auf die wirksamste Antitumortherapie mit reduzierten Nebenwirkungen hinweist. Die Tumorvolumenanalyse (Abb. 9b, b') bestätigte weiterhin den ähnlichen Trend der Tumorwachstumshemmung. Darüber hinaus verlängerte die PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT-Gruppe die Überlebenszeit der tumortragenden Mäuse deutlich über 30 Tage hinaus (67 % und 50 % in den B16F10- und 4T1-Tumormodellen, Abb. 9c, c'). , was viel höher war als bei den anderen Behandlungsgruppen. Bemerkenswerterweise zeigte PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT auch die stärkste hemmende Wirkung auf die Lungenmetastasierung (Abb. 9d, d'), was durch die entsprechende Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) des Lungengewebes bestätigt wurde anschließende Quantifizierungsanalyse (Abb. 9e, e').

a, a' Fotografien von B16F10 (a) und 4T1 (a') tumortragenden Mäusen nach Behandlungen mit Kochsalzlösung, Mn-DTA, PCP-Mn-DTA, GOx, 1-MT, PCP-Mn-DTA@1-MT und PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT für 0, 7 bzw. 18 Tage. b, b' Tumorvolumina und (c, c') Überlebensraten von Mäusen nach verschiedenen Behandlungen. d, d' Fotografien der H&E-Färbung und (e, e') quantitative Analyse der metastatischen Knötchen von B16F10- bzw. 4T1-metastasierten Lungentumor-tragenden Mäusen. f, f' TUNEL-, H&E- und Ki67-Färbebilder für Tumore. g Photoakustische Bilder von sauerstoffhaltigem Hämoglobin (HBO2) und Hämoglobin (HB) und (h) Melaninsignalen an Tumorstellen bei Mäusen nach intratumoraler Injektion von GOx oder PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT für verschiedene Zeitintervalle, mit Bildern repräsentativ für 4 Experimente. Maßstabsleiste: 100 µm für d, d', f und f'. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD dar (n = 6 biologisch unabhängige Proben). Die P-Werte wurden durch den ungepaarten Student-t-Test (zweiseitig) bestimmt, **p < 0,01.

Die hervorragenden Antitumor- und Antimetastasierungswirkungen des PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT-Nanosystems könnten wie folgt erklärt werden. Erstens könnte das Nanosystem, das mit der pH-responsiven Größen-/Ladungsumwandlung ausgestattet ist, die Tumorpermeabilität und Zellaufnahme deutlich erhöhen und dadurch die Wirksamkeit der Abgabe und Bioverfügbarkeit von GOx und 1-MT verbessern. Zweitens könnte GOx aus PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT die Tumorzellen effektiv abtöten und TAAs durch Hungern/Oxidation freilegen47, was zu einer effektiven Rekrutierung der Effektor-T-Zellen führt. Darüber hinaus könnte 1-MT aus PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT die IDO-Expression deutlich unterdrücken und die IDO-vermittelte Immuntoleranz lindern, was zur Rekrutierung von CTLs, B-Zellen und NK-Zellen sowie zur Hemmung von Treg führt Zellvermehrung. Schließlich lieferte das PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT-Nanosystem in Kombination mit der Hunger-/Oxidationstherapie und der IDO-Blockade-Immuntherapie die signifikanteste Antitumorwirkung mit verstärkter Immunaktivierung und geschwächter Immuntoleranz.

Anschließend wurden H&E-, terminale Desoxynukleotidyltransferase-dUTP-Nick-End-Markierung (TUNEL) und Immunfluoreszenz (IFC)-Färbungsanalyse durchgeführt, um die umfassende Antitumoraktivität des Nanosystems in vivo weiter nachzuweisen. PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT verursachte die schwerste Tumorschädigung, wie die deutliche Gewebedissoziation in den H&E-Bildern und zahlreiche magentafarbene Punkte in der TUNEL-Beobachtung zeigen (Abb. 9f, f'). Darüber hinaus bestätigte die IFC-Analyse von Ki67 im Tumorgewebe, dass PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT die Ki67-Expression wirksam herunterregulierte, was seine überlegene Antitumorwirkung bestätigte.

Das nichtinvasive photoakustische Bioimaging wurde zur Messung des intratumoralen Blutsauerstoffspiegels (sO2-Durchschnitt) und der H2O2-Produktion nach intravenöser Injektion von PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT durchgeführt. Die photoakustischen Bilder und quantitativen Ergebnisse zeigten, dass der sO2-Durchschnitt nach der Verabreichung von PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT über 24 Stunden einen Abfall von ~81 % aufwies und die Intensität der photoakustischen Bildgebung von der Tumorstelle entsprechend erhöht war (Abb . 9g und ergänzende Abb. 21). Im Vergleich dazu zeigte die GOx-Gruppe keine signifikante Veränderung. Der Grund könnte wie folgt erklärt werden: (1) Die intratumoralen ROS beschleunigten die GOx-Freisetzung aus dem PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT-Nanosystem, und das freigesetzte GOx verbrauchte den endogenen Sauerstoff und „verhungerte“ den Tumor, was zur Folge hatte bei der Verschlimmerung des lokalen Säuregehalts und des H2O2-Gehalts; (2) die GOx-induzierte Erzeugung von H2O2 verstärkte die Zerlegung des Nanosystems und die GOx-Freisetzung durch eine Kaskadenreaktion weiter; (3) Das aus der Fenton-ähnlichen Reaktion zwischen Mn2+ und H2O2 erzeugte ·OH-Radikal trug ebenfalls zum verstärkten photoakustischen Signal bei48. Bemerkenswerterweise zeigte die quantitative Analyse von Melanin bei Mäusen, dass PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT die Menge an intratumoralem Melanin signifikant reduzierte, während es in der GOx-negativen Gruppe zu einer unbedeutenden Veränderung kam (Abb. 9h und ergänzende Abb. 22). ). Diese Ergebnisse zeigten, dass das PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT-Nanosystem effektiv ROS erzeugte und Melanin reduzierte, was zu einer deutlich verstärkten Wirkung auf die Abtötung von Tumorzellen führte.

Darüber hinaus wurde die biologische Sicherheit des Nanosystems untersucht. Erstens führte PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT im Vergleich zur Kontrolle nicht zu einer kontinuierlichen Abnahme des peripheren Blutzuckers (Abb. 10a), was auf eine überlegene Blutsicherheit schließen lässt. Zweitens die biochemischen Blutwerte sowie die hämatologischen Parameter (Hämatokritwert, mittleres Blutplättchenvolumen, Hämoglobin, Blutplättchen, mittleres korpuskuläres Hämoglobin, rote Blutkörperchen, mittlere korpuskuläre Hämoglobinkonzentration, Verteilungsbreite der roten Blutkörperchen, mittleres korpuskuläres Volumen und weiße Blutkörperchen). Die Leberfunktionsindizes (Aspartataminotransferase und Alaninaminotransferase) und die Nierenfunktionsindizes (Blutharnstoffstickstoff und Kreatinin) blieben nach der Injektion mit PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT im Laufe der Zeit unverändert (ergänzende Abbildung 23), was dies bestätigt eine überlegene Biokompatibilität49. Drittens wurden im Fall der PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT-Gruppe sowohl im B16F10- als auch im 4T1-Tumormodell keine offensichtlichen Organschäden und kein Körpergewichtsverlust beobachtet, wie aus der histologischen und H&E-Analyse hervorgeht (ergänzende Abbildungen 20, 24), was die optimale biologische Sicherheit in vivo bestätigt. Noch wichtiger ist, dass PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT auch die Zirkulationszeit von 1-MT deutlich verlängerte (ergänzende Abbildung 25) und 1-MT mit einer höheren Dosis (fast das Fünffache) effektiv an der Tumorstelle anreicherte im Vergleich zu kostenlosem 1-MT. Darüber hinaus war die Menge der Medikamentenakkumulation im Tumor deutlich höher als in anderen Geweben (p < 0,01), was auf den Abschirmeffekt und die negative Ladung der PEG-Außenschicht50 sowie auf die reduzierte Größe und das Ladungsumkehrdesign des Nanosystems zurückzuführen ist .

a Veränderungen des Blutzuckerspiegels 1 Stunde nach der Behandlung. b Verfahren der Behandlung zur Untersuchung des Rezidivgrades des Tumors. c, c' Tumorrezidivverhältnis von B16F10- und 4T1-tumortragenden Mäusen nach verschiedenen Behandlungen. d, d' FCM und (e, e') entsprechende quantitative Analyse der Häufigkeit von TEM- und TCM-Zellen in der Milz am Tag 8 bei erneuter Belastung von Mäusen mit sekundären B16F10- und 4T1-Tumoren. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD dar (n = 6 biologisch unabhängige Proben). Die P-Werte wurden durch den ungepaarten Student-t-Test (zweiseitig) bestimmt, **p < 0,01. Boxplots zeigen den Median (Mittellinie), das 25. und 75. Perzentil (Box) und das 5. und 95. Perzentil (Whisker) sowie Ausreißer (einzelne Punkte).

Abschließend wurden die Tumor-Rechallenge und die sekundäre Reaktion der Immun-Gedächtnis-T-Zell-Assays durchgeführt, um die Beständigkeit der schützenden Immunwirkung und die mögliche klinische Anwendung des Nanosystems systematisch zu bewerten (Abb. 10b). Wie in Abb. 10c gezeigt, zeigten c', PCP-Mn-DTA, 1-MT und PCP-Mn-DTA@1-MT hohe Tumorrezidivraten (83,3 %–100 %), ähnlich wie in der Kontrollgruppe nach 25 Tagen der Behandlung. Im Vergleich dazu zeigte PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT eine signifikante Verringerung der Rezidivquote auf 33,3 % bzw. 50 % in den B16F10- bzw. 4T1-basierten Tumor-Re-Challenge-Assays, was auf eine wirksame Hemmung des Tumors hindeutet Wiederauftreten des Tumors. Darüber hinaus erhöhte die PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT-Behandlung den Anteil der Effektor-Gedächtnis-T-Zellen (TEM) am 8. Tag (Abb. 10d, e und 10d', e') und 50 (ergänzende Abb. 26) signifikant ) unter der 2. Tumorinfusion, während die Menge der zentralen Gedächtnis-T-Zellen (TCM) entsprechend abnahm (p < 0,01). Es bestätigte den langfristigen sekundären Immunantworteffekt. Die Ergebnisse zeigten, dass das PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT-Nanosystem die Immungedächtnisreaktion erfolgreich und mit langanhaltender Wirksamkeit initiieren konnte. Somit könnte das multifunktionale PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT-Nanosystem mit den Fähigkeiten zur Größenreduzierung und Ladungsumwandlung die Tumorzellen synergistisch abtöten und die Tumormetastasierung über die kombinierten Vorteile einer durch Hunger/Oxidation verstärkten Immunantwortinitiierung und IDO unterdrücken. Blockade der Unterdrückung der Immuntoleranz.

In dieser Studie wurde ein auf pH/ROS reagierendes, abbaubares MOF-Nanoreaktor-basiertes Nanosystem mit selbstverstärkter Freisetzung und verbesserter Penetration entwickelt, um GOx und 1-MT für die kombinierte Hunger-/Oxidationstherapie und IDO-Blockade-Immuntherapie gemeinsam abzugeben Tumoren. Die detaillierten In-vitro- und In-vivo-Ergebnisse haben bestätigt, dass das PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT-Nanosystem nicht nur die Biobarrieren strategisch überwindet und die Abgabeeffizienz über den schwach sauren, auf die Tumormikroumgebung empfindlichen Größen-/Ladungsübergang verbessert, sondern auch Verstärkt wirksam die Aktivierung der Immunantwort mit verringerter Immuntoleranz durch die GOx-aktivierte Hunger-/Oxidationstherapie und die IDO-Blockade-Immuntherapie. Durch die Nutzung dieser Strategien unterdrückt das PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT-Nanosystem wirksam das Tumorwachstum und die Metastasierung. Daher stellt diese Studie ein vielversprechendes Paradigma für die Überwindung der Biobarrieren und die Verstärkung der Aktivierung der Immunantwort sowie die Linderung der Immunresistenz durch die durch Hunger/Oxidation integrierte IDO-Blockade-Immuntherapie dar.

3-Mercaptopropionsäure (4,9 mmol) wurde in Aceton (9,82 mmol) gelöst und 8 Stunden lang gerührt. Anschließend wurde die Lösung über Nacht im Eisbad kristallisiert. Die filtrierten Kristalle wurden wiederholt mit kaltem Wasser und Hexan gewaschen und anschließend im Vakuum getrocknet, um Verbindung 1 zu erhalten (Ausbeute 81 %). 1H-NMR (400 MHz, CD3OD, ppm): 2,85 (t, 4H, -SCH2CH2-), 2,58 (t, 4H, -CH2CH2COOH), 1,58 (s, 6H, -SCCH3CH3S-). ESI-MS: Berechnet. 251.0417, gefunden 251.0404. Die 1H-NMR- und Massenspektren sind in Abb. 2a, b dargestellt.

Die MnCl2-Lösung (107 μL, 50 mg mL-1 in DMF), Verbindung 1 (347 μL, 15 mg mL-1 in DMF), Polyvinylpyrrolidon (K30, 300 mg) und Triethylamin wurden in ein Zentrifugenröhrchen gegeben. Anschließend wurde die DMF/Ethanol-Mischung zugegeben, bis das Volumen 13 ml betrug. Anschließend wurde die Lösung in einen Reaktor überführt und 24 Stunden lang bei 150 °C gehalten. Schließlich wurde das als Mn-DTA bezeichnete Produkt durch Zentrifugation gesammelt (18.500 g) und zur weiteren Verwendung in Ethanol erneut dispergiert.

Kurz gesagt, Cis-Aconitsäureanhydrid (gespendet als CDM, 1 Äquiv.) und Oxalylchlorid (2 Äquiv.) wurden bei 0 °C in trockenem Dichlormethan gelöst. Als nächstes wurde DMF tropfenweise zugegeben und die Mischung 2 Stunden lang auf Raumtemperatur gebracht. Das chloridacetylierte CDM wurde durch Vakuumtrocknung geerntet und dann weitere 2 Stunden lang in Gegenwart von Pyridin mit mPEG-OH umgesetzt. Anschließend wurde das gesättigte Ammoniumchlorid zugegeben, um die Reaktion zu beenden. Die organische Phase wurde zweimal mit eiskaltem Ether extrahiert und ausgefällt. Verbindung 2 (PEG-CDM) wurde durch Vakuumtrocknung geerntet. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3, ppm): 7,95 (s, 1H, -CCHCOO-), 3,71 (m, 464H, -OCH2CH2-), 3,45 (s, 3H, -OCH3) und 2,93 (s, 2H, - OOCH2COO-). FTIR: 2885, 1726, 1633, 1569, 1471 und 1115 cm−1. Die 1H-NMR- und FTIR-Spektren von 2 sind in der ergänzenden Abbildung 4a bzw. der ergänzenden Abbildung 5 dargestellt.

Verzweigtes PEI (0,9 mmol) und Verbindung 2 (0,6 mmol) wurden mit Dimethylsulfoxid (DMSO, 10 ml) bei 0 °C gemischt. Anschließend wurde 4-Dimethylaminopyridin (1,2 mmol) tropfenweise zugegeben und 0,5 h gerührt. Der Reaktionsinhalt wurde im Dunkeln auf Raumtemperatur erwärmt und die Reaktion 2 Stunden lang fortgesetzt. Die Mischung wurde dann 3 Tage lang gegen doppelt destilliertes Wasser dialysiert (MWCO 3,5 kDa). Verbindung 3, auch als PEG-CDM-PEI bezeichnet, wurde durch Lyophilisierung erhalten (Ausbeute: 82 %). 1H-NMR (400 MHz, D2O, ppm): 3,83 (m, 464H, -OCH2CH2-), 3,31 (s, 3H, -OCH3) und 2,62–2,97 (t, -CH2CH2N-). Das Molekulargewicht wurde durch GPC zu 7200 bestimmt, mit einem Polydispersitätsindex von 1,29. FTIR: 2885, 1739, 1645, 1562, 1471 und 1116 cm−1. Die 1H-NMR-, GPC- und FTIR-Spektren von 3 sind in der ergänzenden Abbildung 4b, c bzw. der ergänzenden Abbildung 5 dargestellt.

Mn-DTA (10 mg), 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDC·HCl, 6 mM) und N-Hydroxysuccinimid (NHS, 6 mM) wurden in PBS (pH 7,4, 10) gelöst ml). Nach 1,5-stündigem Rühren wurde Verbindung 3 (0,06 mmol) zur Lösung gegeben, die weitere 36 Stunden lang reagierte. Das als PCP-Mn-DTA bezeichnete Produkt wurde durch Zentrifugation (18.500 g) und Vakuumtrocknung gesammelt.

Mn-DTA (10 mg), GOx (1,33 mg) und 1-MT (2 mg) wurden in PBS (pH 7,4) gelöst. Nach 24-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Mischung zentrifugiert (18.500 g), gefolgt von einer Resuspension in PBS (pH 6,0, 10 ml), das EDC·HCl (15 mM) und NHS (15 mM) enthielt. Die Konjugation von Verbindung 3 wurde ähnlich wie die Synthese der PCP-Mn-DTA-Nanopartikel durchgeführt. Schließlich wurde das wirkstoffbeladene PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT durch Zentrifugation (18.500 g) und Lyophilisierung geerntet.

Die Beladung von GOx und 1-MT in PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT wurde durch UV-Vis-Spektroskopie basierend auf den Standardkurven von GOx bei 276 nm bzw. 1-MT bei 288 nm quantifiziert. Der Wirkstoffbeladungsgehalt (DLC) und die Wirkstoffbeladungseffizienz (DLE) wurden anhand der folgenden Gleichungen berechnet:

Um die Aktivität von GOx zu ermitteln, das im PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT-Nanosystem geladen ist, wurde Glucose (1 mg/ml) mit freiem GOx (200 μg/ml) oder einer äquivalenten Menge GOx-beladenem PCP gemischt -Mn-DTA@GOx@1-MT (2,27 mg/ml). Der Überstand wurde in verschiedenen Zeitintervallen entnommen (0 h, 0,1 h, 0,5 h, 1 h, 1,5 h und 2 h) und die H2O2-Erzeugung und die pH-Änderung wurden überwacht.

PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT (3 mg) wurde zunächst in PBS (1 ml, pH 7,4) ohne oder mit unterschiedlichen Konzentrationen von H2O2 oder Glucose gelöst und anschließend in die Dialysebeutel überführt. Anschließend wurden die Dialysebeutel unter unterschiedlichen Bedingungen unter Rühren (100 U/min) bei 37 °C in PBS (29 ml) getaucht. Das Medium (0,7 ml) wurde in den gewünschten Zeitintervallen (1 Stunde, 2 Stunden, 3 Stunden, 4 Stunden, 5 Stunden, 12 Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden) entnommen und die Beutel mit dem gleichen Volumen aufgefrischt PBS. Das freigesetzte GOx wurde mittels UV-Vis-Spektroskopie bei einer Wellenlänge von 276 nm gemessen.

Kurz gesagt, PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT (1 mg/ml) wurde 6 Tage lang mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) in PBS (pH 7,4 und 6,8) bei 37 °C inkubiert. Die Probenlösung wurde in bestimmten Zeitintervallen (0 h, 6 h, 18 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h und 144 h) entnommen und von DLS erfasst, um die Größenänderungen zu analysieren von PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT.

B16F10-Melanomzellen wurden von der Cell Bank der Chinese Academy of Sciences, China, erworben. Die Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) kultiviert, ergänzt mit 1 % (w/v) Penicillin (100 U/ml)/Streptomycin (100 μg/ml) und 10 % (v/v) FBS mit 5 % CO2 at 37 °C.

Um die Zytotoxizität zu bewerten, wurden die auf den 24-Well-Platten ausgesäten B16F10-Zellen (2 × 104 Zellen pro Quadratzentimeter) mit PBS, 1-MT (7 μM), PCP-Mn-DTA (11,36 μg/ml) und PCP behandelt -Mn-DTA@1-MT, PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT (11,36 μg/ml, entspricht 10 mU/ml GOx und 7 μM 1-MT) und PCP-Mn-DTA@GOx@ 1-MT + Glucose (5,5 mM Glucose) für 24 h und 48 h, gefolgt von einer Inkubation mit der Mischlösung bestehend aus 200 μL frischem Medium und 20 μL CCK-8 bei 37 °C für weitere 1,5 Stunden. Die Absorption bei 450 nm wurde mit einem spektrophotometrischen Mikroplattenlesegerät (Bio-Rad 680, USA) aufgezeichnet.

Die Endozytose der B16F10-Zellen auf dem PCP-Mn-DTA-Nanosystem wurde durch CLSM beobachtet und durch FCM quantitativ analysiert. Einerseits wurden die auf der konfokalen Mikroskopschale ausgesäten B16F10-Zellen mit PBS, FITC-markiertem GOx (GOx-FITC, 10 mU/ml) und PCP-Mn-DTA@GOx-FITC@1-MT bei pH 7,4 behandelt 6,8 für 4 und 12 Stunden. Anschließend wurden die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, mit 0,5 % TritonX-100 permeabilisiert und anschließend mit ActinRed 555 und 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) gefärbt. CLSM (LSM 510 META Olympus) und die Software CellSens Dimension wurden eingesetzt, um die Effizienz der Aufnahme durch die B16F10-Zellen zu untersuchen. Andererseits wurden die mit den verschiedenen Systemen behandelten B16F10-Zellen mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen bei 4 °C zentrifugiert (800 g × 10 min) und gesammelt. Schließlich wurden sie in der Zellbindungslösung (300 μl) resuspendiert und mit FCM (FACS Calibur und Celesta, BD, Biosciences) und der Software FlowJo_V10 analysiert.

Typischerweise wurde DCF-DA als ROS-Sonde verwendet, um die ROS-Erzeugung in den B16F10-Zellen zu überwachen. Kurz gesagt, die auf den 6-Well-Platten oder konfokalen Mikroskopschalen ausgesäten B16F10-Zellen wurden mit GOx, PCP-Mn-DTA, PCP-Mn-DTA@GOx, PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT und PCP-Mn behandelt -DTA@GOx@1-MT + Glucose mit der gleichen GOx-Konzentration. Die zelluläre ROS-Erzeugung wurde mit CLSM abgebildet und mit FCM quantitativ analysiert.

Zunächst wurde heiße Agaroselösung (1,5 %) in eine 96-Well-Platte (80 μl pro Well) gegossen, die abgekühlt wurde, um eine Agaropektinschicht zu bilden. Als nächstes wurden MCS gebildet, nachdem B16F10-Zellen etwa eine Woche lang auf dieser Platte inkubiert wurden19. Als nächstes wurden MCSs auf zwei Platten mit 6 Vertiefungen übertragen, die DMEM mit unterschiedlichen pH-Werten enthielten, gefolgt von einer Behandlung mit den mit FITC markierten PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT-Nanopartikeln (11,36 μg/ml) für 4 und 12 Stunden. Die resultierenden MSCs wurden mit PBS gewaschen, in frischem Medium resuspendiert und anschließend mit CLSM nachgewiesen.

Kurz gesagt, IDO1 (IDO1-Gen wurde mit Lipofectamine®3000 transfiziert, NCBI-Gen)-transfizierte B16F10-positive Zellen und B16F10-Zellen wurden mit PBS, PCP-Mn-DTA, 1-MT, PCP-Mn-DTA@1-MT und inkubiert PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT für jeweils 24 Stunden. Anschließend wurden die Zellen lysiert und durch Zentrifugation (800 g × 10 min, 4 °C) gewonnen. Die Western-Blot-Analyse wurde verwendet, um die Expression von IDO1 zu messen.

IFN-γ-stimulierte B16F10-Zellen (1 × 105 Zellen/Well) wurden mit den T-Zellen (5 × 105 Zellen/Well) in einer 24-Well-Platte gemischt, gefolgt von der Behandlung mit 1-MT, PCP-Mn-DTA, PCP-Mn-DTA@1-MT bzw. PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT. Nach 12-stündiger Co-Kultivierung wurden die Lymphozyten gewonnen und mit EdU (10 μM) für die FCM-Analyse inkubiert.

Nachdem die Konfluenz der auf den konfokalen Mikroskopschalen ausgesäten B16F10-Zellen 60–70 % erreicht hatte, wurden die Zellen mit FITC-markiertem PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT (11,36 μg/ml) und Lysotracker Red (1 μM) inkubiert. bei 37 °C für 1, 3 und 8 Stunden. Anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mittels CLSM beobachtet.

Sobald die Konfluenz der in einer 6-Well-Platte ausgesäten B16F10-Zellen 60–70 % erreichte, wurden die Zellen mit PBS (Kontrolle), 1-MT (7 μM), PCP-Mn-DTA (11,36 μg/ml) behandelt. PCP-Mn-DTA@1-MT, PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT (11,36 μg/ml, entspricht 7 μM 1-MT) und PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT + Glucose ( 5,5 mM Glucose) für 24 Stunden. Anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugation (800 g) gewonnen und mit dem Annexin V-FITC/PI-Kit (NeoBioscience) gemäß den Anweisungen gefärbt, gefolgt von der FCM-Analyse.

Auf den 6-Well-Platten ausgesäte B16F10-Zellen wurden mit PBS, 1-MT (7 μM), PCP-Mn-DTA, PCP-Mn-DTA@1-MT, PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT ( 11,36 μg/ml, entsprechend 7 μM 1-MT) bzw. PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT + Glucose für 24 Stunden. Anschließend wurden die Zellen lysiert und die Proteinproben durch Zentrifugation (18.500 g) gesammelt. Western Blot (Gel DocTM XR + , Bio-Rad) und ImageJ-Software 1,45 f wurden verwendet, um die Expression von Bax, Bcl-2 und Cyt-C zu überwachen und zu analysieren (ergänzende Abbildung 27).

Die B16F10-Zellen wurden in die 6-Well-Platten ausgesät und 24 Stunden lang inkubiert. Nach 24-stündiger Behandlung mit PBS, PCP-Mn-DTA, 1-MT, PCP-Mn-DTA@1-MT und PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT entstand durch Verwundung der konfluenten Zelle eine Kratzwunde Monoschichten mit einer p200-Pipettenspitze. Anschließend wurden die Zellen gewaschen, um das Nanosystem zu entfernen. Nach 24 Stunden wurden die Bilder der Wundheilung mit einem Mikroskop (Olympus) aufgenommen.

Die B16F10-Zellen wurden 24 Stunden lang mit den verschiedenen hier verwendeten Systemen behandelt. Später wurden die Zellen verdaut und durch Zentrifugation (800 g) gesammelt. Für das Zellmigrationsexperiment wurden die Zellen in einem serumfreien Medium resuspendiert und anschließend in einer Dichte von 1 × 105 Zellen in die obere Kammer von Transwell überführt. Für das Invasionsexperiment wurden 2 × 105 B16F10-Zellen auf dem vorab abgedeckten Transwell-Matrixgel kultiviert. Währenddessen wurde der unteren Kammer ein Medium mit 10 % FBS als chemischer Lockstoff zugesetzt. Nach 24-stündiger Inkubation wurden die Zellen auf der Unterseite von Transwell mit Kristallviolett gefärbt. Anschließend wurden sie gezählt und unter dem Mikroskop abgebildet.

C57BL/6-Mäuse und Balb/c-Mäuse (ca. 6 Wochen alt) wurden von der Beijing Institution for Drug Control (China) gekauft. Alle Tiere wurden in der pathogenfreien Anlage mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und einer relativen Luftfeuchtigkeit (40–70 %) bei 21 ± 2 °C gezüchtet. Alle Mäuse hatten nach Belieben Zugang zu Futter und Wasser. Die Tierstudien wurden gemäß den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee der Northwestern Polytechnical University durchgeführt. Die tumortragenden Mausmodelle wurden durch Inokulation von B16F10- oder 4T1-Zellen (100 µL, Konzentration 1 × 106) in PBS in die rechte Flanke der C57BL/6- oder Balb/c-Mäuse19 etabliert. Sobald das Tumorvolumen etwa 50 mm3 erreichte, wurden sieben Gruppen tumortragender Mäuse intravenös mit Kochsalzlösung, Mn-DTA, PCP-Mn-DTA, GOx, 1-MT, PCP-Mn-DTA@1-MT und PCP injiziert -Mn-DTA@GOx@1-MT in einer Dosis von 3 mg/kg 1-MT (n = 6). Diese Behandlungen wurden zweimal pro Woche durchgeführt und dauerten 18 Tage. Das Tumorvolumen und das Körpergewicht der Mäuse wurden alle 2 Tage gemessen. Das Tumorvolumen (V) wurde mithilfe der Gleichung berechnet:

Dabei ist L die längste Ausdehnung des Tumors und S die kürzeste Ausdehnung des Tumors. Nach der letzten Behandlung wurde die Überlebensrate der Maus für weitere 15 Tage aufgezeichnet.

Den B16F10- und 4T1-Zellen tragenden Mäusen wurden die gleichen sieben Formulierungen intravenös injiziert. Die Injektionen erfolgten zweimal alle 2 Tage. Anschließend wurden die Tumorgewebe herausgeschnitten, verdaut und in monodisperse Lymphozyten geerntet. Die erhaltenen Lymphozyten wurden mit Anti-CD4-FITC-, Anti-CD3-APC/Cy7- und Anti-CD8-Percp/Cy5.5-Antikörpern zur Analyse der CD4+- (CD3+CD4+CD8−) und CD8+-T-Zellen kogefärbt ( CD3+CD4−CD8+), comarkiert mit Anti-CD3-APC/Cy7 und Anti-CD49b-PE/Cy7 zur Analyse der NK-Zellen (CD3−CD49b+), comarkiert mit Anti-CD3-APC/Cy7 und anti -CD45R/B220-PE zur Analyse der B-Zellen (CD3−CD45R/B220+), gemeinsam mit Anti-CD80-APC, Anti-CD86-PE und Anti-CD11b-FITC zur Analyse der reifen dendritischen Zellen (CD11b+CD80) markiert +CD86+) und gemeinsam mit Anti-CD4-FITC, Anti-Foxp3-Alexa 647 und Anti-CD3-APC/Cy7 für die Analyse der Treg-Zellen mittels FCM gemäß den Verfahren des Herstellers markiert.

Die von den behandelten Mäusen gesammelten Splenozyten wurden gemäß den Verfahren des Herstellers mit Anti-CD44-FITC-, Anti-CD3-PerCP-Cy5.5-, Anti-CD62L-APC- und Anti-CD8-PE-Antikörpern markiert. Anschließend wurde der Nachweis mit FCM durchgeführt, um die zentralen und Effektor-Gedächtnis-T-Zellen zu messen.

Den B16F10-Zellen tragenden Mäusen wurden die Formulierungen alle 3 Tage fünfmal intravenös injiziert. Die Tumorproben wurden geerntet, homogenisiert, zentrifugiert und mithilfe von Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (HPLC-MS) gemessen.

Tumortragenden Mäusen wurde für verschiedene Zeitintervalle intravenös GOx oder PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT injiziert. Die photoakustischen Signale von sauerstoffhaltigem Hämoglobin, Hämoglobin und Melanin an Tumorstellen wurden mit iThera Medical MSOT inVision 128 (iThera Medical) erfasst und mit der Software ViewMOST (Version 3.8.1.09) analysiert.

Die Mäuse wurden nach der 18-tägigen Behandlung getötet. Milz, Niere, Lunge, Herz, Leber und Tumor wurden reseziert und in Schnitte geschnitten. Für den H&E-Assay wurden die Gewebeschnitte mit H&E gefärbt und unter Verwendung eines Mikroskops (BX53, Olympus) mit der CellSens Entry-Software abgebildet. Für den TUNEL-Assay wurden die Tumorschnitte mit den TUNEL-Mitteln (Beyotime) gefärbt und mit einem CLSM abgebildet. Für die IFC-Studie wurden die Tumorabschnitte mit 5 % Rinderserumalbumin blockiert und mit Ki67-, IDO-, mTOR- oder STAT3-Antikörper inkubiert. Anschließend wurden sie gemäß den Anweisungen des Herstellers (Immunol Fluoreszenz Staining Kit, Beyotime, China) mit Alexa Fluor 488-markiertem IgG oder Cy3-markiertem Zweitantikörper gefärbt. Abschließend wurden die Schnitte mit DAPI gefärbt und mit einem CLSM charakterisiert.

PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT wurde zusammen mit der Kontrolle (Kochsalzlösung) intravenös in die Mäuse injiziert. Nach einer Stunde Verabreichung wurde Blut zur Blutzuckerbestimmung entnommen. Der Blutzuckerspiegel der Mäuse wurde vor und nach der Verabreichung mit einem Blutzuckermessgerät gemessen. Zusätzlich wurde das Blut der Mäuse nach der letzten Behandlung direkt aus den Augen entnommen. Die Blutproben wurden über Nacht bei 4 °C gelagert und zur Abtrennung des Plasmas 20 Minuten bei 900 g zentrifugiert. Anschließend wurden die biochemischen Blutspiegel und hämatologischen Parameter sowie die Leber- und Nierenfunktionsindizes gemäß den von den Herstellern empfohlenen Protokollen bestimmt.

Den B16F10-tumortragenden C57BL/6-Mäusen wurde freies 1-MT und PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT in einer äquivalenten 1-MT-Dosis von 3 mg/kg intravenös injiziert. Zur pharmakokinetischen Untersuchung wurde in den gewünschten Zeitintervallen Blut aus dem Orbitalplexus entnommen und heparinisiert. Das Plasma wurde durch Zentrifugation (2000 g) geerntet. Dann wurde Acetonitril zugegeben, um die Proteine ​​auszufällen, gefolgt von einer 8-minütigen Zentrifugation bei 18.500 g, um den Überstand zu sammeln. Abschließend wurde die gesammelte Probe getrocknet, erneut aufgelöst und mittels HPLC nachgewiesen. Für die Bioverteilungsstudie wurden die Mäuse nach 24 Stunden getötet und der Tumor und die Hauptorgane gesammelt und in DMSO (0,5 ml) homogenisiert, gefolgt von einer 15-minütigen Zentrifugation bei 16.000 g. Die Menge an 1-MT in diesen Organen wurde durch HPLC bestimmt.

Nach der primären Tumorimpfung wurden den B16F10-tragenden C57BL/6-Mäusen und 4T1-tragenden Balb/c-Mäusen (n = 6) Kochsalzlösung (Kontrolle), Mn-DTA, PCP-Mn-DTA, GOx, 1-MT intravenös injiziert , PCP-Mn-DTA@1-MT und PCP-Mn-DTA@GOx@1-MT an den Tagen -6, -4 und -2. Die Primärtumoren wurden am Tag 0 chirurgisch entfernt, und die Mäuse wurden erneut subkutan mit den 4T1- oder B16F10-Zellen infiziert und auf das Wiederauftreten der Sekundärtumoren überwacht.

Die statistische Analyse wurde mit der OriginPro-Software (Version 9.0 und 2022) mittels Student-t-Test und einseitiger Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt. Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt. Als signifikanter Unterschied wurden die Konfidenzniveaus 95 % und 99 % angesehen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien sowie auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (52003223 (LD), 11722220 (HY) und 11672246 (HY)), dem National Key R&D Program of China (2016YFC1100300 (KC)), dem Key R & D Programm der Provinz Shaanxi (2022SF-012 (LD)) und der Nachwuchsfonds der University Association for Science and Technology in Shaanxi (20200302 (LD)). Diese Arbeit wurde teilweise durch das AME IRG-Stipendium der Singapore Agency for Science, Technology and Research (A*STAR) (A20E5c0081 (YZ)) und die Singapore National Research Foundation Investigatorship (NRF-NRFI2018-03 (YZ)) unterstützt.

Institut für medizinische Forschung, Northwestern Polytechnical University, Xi'an, 710072, VR China

Liangliang Dai, Zhenxiang Fu, Siyu Meng und Zhang Yuan

Abteilung für Chemie und biologische Chemie, School of Physical and Mathematical Sciences, Nanyang Technological University, 21 Nanyang Link, Singapur, 637371, Singapur

Liangliang Dai & Yanli Zhao

School of Life Sciences, Northwestern Polytechnical University, Xi'an, 710072, VR China

Mengjiao Yao, Xiang Li, Xinmin Zheng und Hui Yang

Schlüssellabor für biorheologische Wissenschaft und Technologie, Ministerium für Bildung, Hochschule für Bioingenieurwesen, Chongqing-Universität, Chongqing, 400044, VR China

Kaiyong Cai

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LD hat das Projekt konzipiert. LD und MY haben die Experimente entworfen und die Ergebnisse analysiert. MY und SM führten konfokale Mikroskopie-Bildgebung durch. MY, ZF und XL führten Western-Blot-Assays und -Analysen durch. MY, ZF und XZ führten die In-vivo-Studien durch. ZY unterstützte die histologische und Immunfluoreszenzanalyse. KC, HY und YZ sorgten für die Diskussionen. Der Artikel wurde von LD, MY und YZ verfasst. Alle Autoren beteiligten sich an den allgemeinen Diskussionen und überprüften den Artikel.

Korrespondenz mit Kaiyong Cai, Hui Yang oder Yanli Zhao.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Peng Huang und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Dai, L., Yao, M., Fu, Z. et al. Multifunktionaler Nanoreaktor auf Basis eines metallorganischen Gerüsts für eine durch Hungern/Oxidation verbesserte Indoleamin-2,3-Dioxygenase-Blockade-Tumorimmuntherapie. Nat Commun 13, 2688 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30436-y

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Eingegangen: 07. Februar 2021

Angenommen: 20. April 2022

Veröffentlicht: 16. Mai 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30436-y

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